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[交流] 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因已有14人参与

大家好，我构建表达载体连接PET-28A，已经连接多次但都失败，感受态细胞也换了几次，鉴定全是假阳性，这可能是什么原因呢，希望大家多多帮忙！

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1楼 2010-05-08 14:27:43

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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲

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注册: 2008-09-09
专业: 疫苗学

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

1、我也是用B..I和 Hind III进行的，插入片段300bp，ok，并且还改掉了其抗性。
2、插入片段的mol数量比值，800bp左右的话，按照大约5-8：1于载体。
3、连接时，用的T4连接酶吗？可以16℃过夜。
4、因为6kb大小了，并此质粒拷贝度不高，提取质粒后，注意用量，酶切可用单切+单切+双切互为对照。
5、也可用片段两侧引物pcr检测
6、注意抗生素是否失效？添加浓度等。
祝福好运！