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【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因已有14人参与
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| 大家好，我构建表达载体连接PET-28A，已经连接多次但都失败，感受态细胞也换了几次，鉴定全是假阳性，这可能是什么原因呢，希望大家多多帮忙！ |
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chemifunan
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-08 18:42:15
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片段切好了就不会有问题 载体要好好切切 pET28a拷贝数很低 载体抽质粒时抽浓一些 切好一批量大的放着每次取个半微升以后省事 告诉我酶切位点 28a很大 5.5k克隆几百bp 会不会你鉴定的时候切下来的小片段太稀了没看见啊 倒个1.2%的胶 构建好以后抽浓点切 酶要过量 温育3h以上 跑胶再看 酶切鉴定 TAE就不用了 看不出什么来 直接抽提 kana用50就行 用普通的克隆菌 不要用BL21 等确定对了纯了再转BL21 你直接连接测序怎么办？ pET通用引物有的 但是中国很多公司给的不对 你在哪个城市 上海这边不行 我一般PCR产物测完了对了再连 |
8楼2010-05-08 16:32:15
chemifunan
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14楼2010-05-13 08:42:49
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lstt09nk(金币+3):感谢交流~~ 2010-05-19 21:24:18
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另外5楼的同学所指的单酶切意思是叫你分步酶切 B/H不用分步也可以切开可以共用Buffer 我觉得你不是这个问题 你说的假阳性是指转进去空载体的意思吧 那应该是你载体没切好 然后连接时片断和载体比例不对 请版主大人照顾一下楼主 去掉自动奖励 他金币本来不多 以后没法提问题了 实在不行你这样 找一个克隆载体 先连上再说 然后重新切下来(这样片断就多了) 切一批 然后pET载体按上次我说的方法 克隆载体下来的片断和pET再连一次 多一步 连接一定要找手感 连上了以后总能连上 pET不是克隆载体但是可以用作分子克隆 其实图省事但是不方便 |
15楼2010-05-13 08:51:12