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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因
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zsy0625

木虫 (小有名气)

小博
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689352楼: Originally posted by plantaqp at 2010-05-09 03:50:14:
目的片段浓度越低效率越低，所以把目的片段浓度提高了在连接吧，否则费时费力有费神！

请问浓度要多少合适？我也是最近在做pet28a表达载体构建。。。没有连上。。。
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燃烧吧，小宇宙~
21楼2012-04-18 17:05:22
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zhuzhicheng

新虫 (初入文坛)
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如果是双酶切一定是载体没有完全切开 形成很多单酶切的载体 这样的载体连接效率比双酶切连外源片段效率高100倍  就是说你挑100个菌 才有一个可能是阳性 这叫载体自连 板子可以扔了
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22楼2013-10-11 15:56:54
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yuan爱

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9楼: Originally posted by zhy19850501 at 2010-05-08 16:51:02
我的酶切位点是BamHI和HandIII,你是建议我把双酶切后的PET-28载体转化到克隆菌中吗，这怎么鉴定它的纯度？...

你的酶切体系是什么呢
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23楼2016-03-07 13:08:06
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xfhysss-314

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by chemifunan at 2010-05-08 16:32:15
片段切好了就不会有问题 载体要好好切切
pET28a拷贝数很低 载体抽质粒时抽浓一些 切好一批量大的放着每次取个半微升以后省事
告诉我酶切位点
28a很大 5.5k克隆几百bp 会不会你鉴定的时候切下来的小片段太稀了没看 ...

你好，我最近在做表达载体的构建，其中双酶切之后载体和目的片段的条带都很亮，但是回收效率可能有点低，但是并不至于条带是淡淡的看不见，连好多次都没有成功，不知道是哪里出了问题，希望楼主帮忙分析一下，不胜感激！
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24楼2018-12-18 15:30:30
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