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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因
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zhy19850501

[交流] 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因 已有14人参与

大家好，我构建表达载体连接PET-28A，已经连接多次但都失败，感受态细胞也换了几次，鉴定全是假阳性，这可能是什么原因呢，希望大家多多帮忙！
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1楼 2010-05-08 14:27:43
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junxiao0320

金虫 (小有名气)

学生
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by plantaqp at 2010-05-09 03:50:14:
目的片段浓度越低效率越低，所以把目的片段浓度提高了在连接吧，否则费时费力有费神！

请教一下，我连啦两个月了，用的PQE30载体，连，504bp的片段，感觉连上了，但是酶切验证时，载体片段偏小，测序目的序列正确。旁边的载体序列不对。《补充：用的酶切位点：SPHI,SALI》

同时我用这个载体ECORI，SPHI 连了一个467的片段，酶切验证片段的浓度总是很低，次序正确了，再用这个载体连504的片段，酶切验证：切得片段就是不对
我转化到啦表达宿主菌，是不是有问题啊
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寻找方向，前进
19楼2012-03-15 11:19:06
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1。提取过质粒吗，是空载体吗，会不会是某种酶没有切开啊，或者是片段或者是质粒。连接时片段的量一定要远高于载体的片段，至少片段：载体>3吧
2。感受态可能没有问题，毕竟有菌长起来，要是验证感受态的话，可以转点质粒看看。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
2楼2010-05-08 14:44:43
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zhy19850501

我的目的片段浓度可能比较低，但不至于一点都连不上吧，我提的质粒确实是空载。
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3楼2010-05-08 15:09:49
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-08 18:50:34
你用的是蓝白筛选吗？如果是蓝白筛选，那么选的白斑就绝对不是空载，而是连接的片段太小，你没有看到而已，所以我有可能是质粒污染。但是污染也不可能没有阳性，那你没有阳性，很有可能还是连接的问题，没有连上是最大的原因。你连接的片段是PCR产物，还是胶回收产物，还是其他什么片段，浓度怎么样，长度多大
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4楼2010-05-08 15:22:25
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