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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 如何做一个基因的荧光定量pcr,从目的基因的查找，引物设计，...
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liliuyan

新虫 (初入文坛)

[求助] 如何做一个基因的荧光定量pcr,从目的基因的查找，引物设计，... 已有1人参与

如何做一个基因的荧光定量pcr,从目的基因的查找，引物设计，到做一个完整的荧光定量pcr具体的步骤。万分感谢  。跪求。

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1楼 2017-02-13 20:49:57
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Q_小白
顶

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4楼2017-02-13 23:13:57
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莫等闲111

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【答案】应助回帖

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西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2017-02-13 23:01:41
1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶）

   1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。

   2）取100mg组织，加入到匀浆器中。

   3）充分研磨直至无可见组织块。

   4）13000g离心10min取上清。

   5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。

   6）4℃下13000g离心8min。

   7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。

   8）-20℃放置15min。

   9）4℃下13000g离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。

   10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。

   11）4℃下13000g离心5min。

   12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。

   13）加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。

   14）55℃孵育5min。

2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶）

   1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。

   2）加入1μl oligo(dT)15。

   3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。

   4）于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却。

   5）依次加入4μl  5×buffer，2μl  10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。

   6）于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。

3、定量PCR

   1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。

   2× qPCR Mix  12.5μl

   7.5μM基因引物 2.0μl

   反转录产物  2.5μl

   ddH2O   8.0μl

   2）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。

   2×qPCR Mix  12.5μl

   7.5μM内参引物 2.0μl

   反转录产物  2.5μl

   ddH2O   8.0μl

   3）PCR扩增

   预变性    95℃，10min

   循环（40次）      95℃，15s→60℃，60s

   溶解曲线   75℃→95℃，每20s升温1℃

4、结果处理

   ΔΔCT法：

   A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本)

   B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本)

   K=A-B

   表达倍数=2-K

   注意事项

   1、长度：15—30bp。

   2、G十c含量：应在40%一60%之间。

   3、碱基分布的随机性

   4、引物自身：最好不要含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。

   5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。

   6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。

   7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。

   8、设计RT-PCR的引物时，上下游引物要跨内含子，以消除基因组DNA的干扰。

   9、引物设计好后再NCBI上进行序列比对，检查是否可能有错配产物扩增。

   10、引物设计要注意种属。
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2楼2017-02-13 22:27:58
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莫等闲111

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3楼2017-02-13 22:30:46
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