| 查看: 2190 | 回复: 3 | |||
[求助]
如何做一个基因的荧光定量pcr,从目的基因的查找，引物设计，... 已有1人参与
|
|
如何做一个基因的荧光定量pcr,从目的基因的查找，引物设计，到做一个完整的荧光定量pcr具体的步骤。万分感谢 。跪求。 发自小木虫Android客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有247人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 真菌的绝对定量荧光pcr如何做标准曲线
已经有3人回复
- 荧光定量PCR引物的选择
已经有1人回复
- 荧光定量不同板之间的比较，没有内标准基因如何做？
已经有0人回复
- 水稻材料做荧光定量，取样品及后续实验该怎么操作
已经有0人回复
- 荧光定量PCR标准曲线的问题
已经有3人回复
- 荧光定量PCR数据处理——SD值及方差分析
已经有5人回复
- 如何在丝状真菌中表达如何蛋白
已经有3人回复
- 荧光定量PCR的相对定量怎么用？
已经有5人回复
- 荧光定量pcr,以及内参基因的选择。
已经有4人回复
- 原位杂交 与 gus 染色 需不需要都做
已经有8人回复
- 拿到基因全长，做什么？
已经有10人回复
- 如何让绿色荧光蛋白在Hela细胞中表达
已经有5人回复
- 荧光定量的虫友们交流交流
已经有4人回复
- 【求助/交流】这种情况下如何做荧光定量啊
已经有4人回复
- 【求助/交流】ACTIN基因如何寻找~~Actin-like基因是什么？？
已经有6人回复
- 【求助/交流】人类基因的污染
已经有6人回复
- 荧光定量PCR反应中的对照如何设定
已经有0人回复
- 【分享】realtime pcr 个人经验分享
已经有41人回复
- 【专题】PCR实验技术指南
已经有535人回复
莫等闲111
版主 (知名作家)
- 应助: 67 (初中生)
- 贵宾: 4.496
- 金币: 85540.9
- 散金: 10147
- 红花: 230
- 沙发: 6
- 帖子: 7126
- 在线: 1196.9小时
- 虫号: 4086716
- 注册: 2015-09-20
- 性别: GG
- 专业: 微生物学
- 管辖: 外文书籍求助
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2017-02-13 23:01:41
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+5, 鼓励热心回帖交流 2017-02-13 23:01:41
|
1、总RNA抽提（枪头和离心管均经过湿热灭菌，无RNA酶） 1）取匀浆器，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。 2）取100mg组织，加入到匀浆器中。 3）充分研磨直至无可见组织块。 4）13000g离心10min取上清。 5）加入250 μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。 6）4℃下13000g离心8min。 7）将上清转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。 8）-20℃放置15min。 9）4℃下13000g离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。 10）吸除液体，加入75%乙醇1.5ml洗涤沉淀。 11）4℃下13000g离心5min。 12）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。 13）加入20μl无RNA酶的水溶解RNA。 14）55℃孵育5min。 2、反转录（枪头和PCR均经过湿热灭菌，无RNA酶） 1）取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。 2）加入1μl oligo(dT)15。 3）用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。 4）于PCR仪上70℃保温5min，迅速置冰上冷却。 5）依次加入4μl 5×buffer，2μl 10mM dNTPs，1μl RNA inhibitor和1μl 反转录酶，用枪抽吸混匀。 6）于PCR仪上42℃保温60min，结束后80℃保温5min灭活反转录酶。 3、定量PCR 1）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。 2× qPCR Mix 12.5μl 7.5μM基因引物 2.0μl 反转录产物 2.5μl ddH2O 8.0μl 2）取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。 2×qPCR Mix 12.5μl 7.5μM内参引物 2.0μl 反转录产物 2.5μl ddH2O 8.0μl 3）PCR扩增 预变性 95℃，10min 循环（40次） 95℃，15s→60℃，60s 溶解曲线 75℃→95℃，每20s升温1℃ 4、结果处理 ΔΔCT法： A=CT(目的基因，待测样本)- CT(内标基因，待测样本) B=CT(目的基因，对照样本)- CT(内标基因，对照样本) K=A-B 表达倍数=2-K 注意事项 1、长度：15—30bp。 2、G十c含量：应在40%一60%之间。 3、碱基分布的随机性 4、引物自身：最好不要含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。 5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。 6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。 7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。 8、设计RT-PCR的引物时，上下游引物要跨内含子，以消除基因组DNA的干扰。 9、引物设计好后再NCBI上进行序列比对，检查是否可能有错配产物扩增。 10、引物设计要注意种属。 |
2楼2017-02-13 22:27:58
莫等闲111
版主 (知名作家)
- 应助: 67 (初中生)
- 贵宾: 4.496
- 金币: 85540.9
- 散金: 10147
- 红花: 230
- 沙发: 6
- 帖子: 7126
- 在线: 1196.9小时
- 虫号: 4086716
- 注册: 2015-09-20
- 性别: GG
- 专业: 微生物学
- 管辖: 外文书籍求助
3楼2017-02-13 22:30:46
4楼2017-02-13 23:13:57
40