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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 构建的表达载体， 双酶切出现杂带，求助分析原因
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笀书丶

新虫 (初入文坛)

[求助] 构建的表达载体， 双酶切出现杂带，求助分析原因 已有2人参与

最近在构建表达载体，构建完成后进行单双酶切鉴定， 发现自己的目的条带位置正确，但是发现存在一条杂带，无论单双酶切还是跑质粒，杂带都存在，请问是什么原因？ 如图，是我挑了三个菌落后，提质粒双酶切的图， 5000maker  目的条带在545bp处

构建的表达载体， 双酶切出现杂带，求助分析原因
重组质粒双酶切鉴定.jpg
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1楼 2016-11-20 15:20:26
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鱼》

新虫 (正式写手)
是不是载体上还有你用的酶的酶切位点

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2楼2016-11-20 15:41:17
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迷路人啊

新虫 (小有名气)
没有切开的超螺旋质粒吧？

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3楼2016-11-20 16:21:52
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笀书丶

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 鱼》 at 2016-11-20 15:41:17
是不是载体上还有你用的酶的酶切位点

不是 ， 我用的Nco-BamH这两个位点， 载体上不存在这两个位点的，无论用这两种酶单切 还是双切， 杂带都存在， 跑质粒，这条带也存在。
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4楼2016-11-20 17:00:03
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鱼》

新虫 (正式写手)
你用空载体跑一下对照，验证空载体污染吗

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5楼2016-11-20 17:43:50
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笀书丶

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 迷路人啊 at 2016-11-20 16:21:52
没有切开的超螺旋质粒吧？

我不敢确定， 但是无论是单跑这个质粒，还是双酶切，单酶切。这个带都会存在，而且都在那个位置上， 主要我担心它会不会对我的后续实验产生影响
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6楼2016-11-21 12:37:20
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迷路人啊

新虫 (小有名气)
转表达宿主在提质粒也是这样吗？

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7楼2016-11-21 13:50:36
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
笀书丶: 金币+2, ★有帮助 2016-11-22 10:37:24
质粒对照上如果还有的话可能就是没切开，可以换个酶试试

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···
8楼2016-11-21 23:28:44
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生物狗-哈

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 笀书丶 at 2016-11-20 17:00:03
不是 ， 我用的Nco-BamH这两个位点， 载体上不存在这两个位点的，无论用这两种酶单切 还是双切， 杂带都存在， 跑质粒，这条带也存在。...

可以将质粒涂下板，挑单菌落鉴定下，看下是不是有污染其他的东西。也可以试下Vazyme同源重组的方法重新构建，一天时间就可以拿到克隆了
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9楼2016-12-28 15:52:58
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yangxp2006

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

更换电泳缓冲液，重新制胶。应该是电泳时带入的。。。
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10楼2016-12-28 20:36:21
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