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Pushing2012

金虫 (正式写手)

[求助] 表达载体构建

本人打算用双酶切构建pet28a表达载体，用BamH1和Not1做双酶切，两个酶切效率不一样，想请教各位大虾，酶切时间一般用多久，BamH180度不易灭活，那么酶切完后不进行灭活对后面的连接有影响没
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1楼2013-06-03 20:35:33
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

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Pushing2012(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-04 18:12:07
我切质粒用的时间一般是3个小时
不灭活不会影响连接的, 酶切反应过后有纯化这个步骤.
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2楼2013-06-04 02:10:21
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窝窝头

新虫 (小有名气)

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切2-3个小时不行，就切过夜。
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3楼2013-06-04 07:44:41
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

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Pushing2012(myprayer代发): 金币+1, Send person rose fragrance in hand, thank you loosen one\'s purse strings generously, look forward to your wonderful 2013-06-04 18:12:19
BamHI最好过柱子去蛋白，这个酶死不掉。至于酶切时间我一般不超过1h,如果1h切不开那么就是1天也切不开的。
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4楼2013-06-04 10:02:54
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whb21

木虫 (著名写手)

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酶切时间3-5小时足够了，切完之后对DNA片段进行一下纯化就好了
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5楼2013-06-04 13:12:47
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

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酶切后，跑个琼脂糖凝胶电泳，回收一下，损失肯定有的，但是核酸的质量比较高，有利于连接的。
不要贪多，正确的克隆有三五个就够了。
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6楼2013-06-04 13:30:14
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huoyongting

金虫 (正式写手)

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用的酶不好吧，用NEB的内切酶，1h搞定
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7楼2013-06-04 15:30:40
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84146922

金虫 (小有名气)

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看用的酶的公司
TAKARA的一般2-3小时，快速酶半小时内
NEB的1小时左右。
不用灭活，PCR纯化即可
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8楼2013-06-04 21:25:05
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王者归来001

木虫 (小有名气)

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一般37 切2h，切完后需要回收再用连接酶连接。
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坚持不懈,终会成功!
9楼2013-06-04 22:53:18
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taojun

木虫 (著名写手)

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我一般是37度，5小时就可以了啊！
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10楼2013-06-05 01:33:42
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