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Pushing2012

金虫 (正式写手)

[求助] 表达载体构建

本人打算用双酶切构建pet28a表达载体,用BamH1和Not1做双酶切,两个酶切效率不一样,想请教各位大虾,酶切时间一般用多久,BamH180度不易灭活,那么酶切完后不进行灭活对后面的连接有影响没
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

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Pushing2012(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-06-04 18:12:07
我切质粒用的时间一般是3个小时
不灭活不会影响连接的, 酶切反应过后有纯化这个步骤.
2楼2013-06-04 02:10:21
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窝窝头

新虫 (小有名气)

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切2-3个小时不行,就切过夜。
3楼2013-06-04 07:44:41
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

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BamHI最好过柱子去蛋白,这个酶死不掉。至于酶切时间我一般不超过1h,如果1h切不开那么就是1天也切不开的。
4楼2013-06-04 10:02:54
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whb21

木虫 (著名写手)

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酶切时间3-5小时足够了,切完之后对DNA片段进行一下纯化就好了
5楼2013-06-04 13:12:47
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

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Pushing2012(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-06-04 18:12:35
酶切后,跑个琼脂糖凝胶电泳,回收一下,损失肯定有的,但是核酸的质量比较高,有利于连接的。
不要贪多,正确的克隆有三五个就够了。
6楼2013-06-04 13:30:14
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huoyongting

金虫 (正式写手)

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用的酶不好吧,用NEB的内切酶,1h搞定
7楼2013-06-04 15:30:40
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84146922

金虫 (小有名气)

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看用的酶的公司
TAKARA的一般2-3小时,快速酶半小时内
NEB的1小时左右。
不用灭活,PCR纯化即可
8楼2013-06-04 21:25:05
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王者归来001

木虫 (小有名气)

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一般37 切2h,切完后需要回收再用连接酶连接。
坚持不懈,终会成功!
9楼2013-06-04 22:53:18
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taojun

木虫 (著名写手)

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我一般是37度,5小时就可以了啊!
10楼2013-06-05 01:33:42
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