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zhangfeibird铜虫 (小有名气)
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pcDNA3.1-SV40大T抗原表达载体构建，没有菌落产生
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我最近在构建pcDNA3.1-SV40大T抗原表达载体。 pcDNA3.1（+）表达载体BamHI、EcoRI双酶切，胶回收，获得线性片段大小为5200bp左右，浓度为22 ng/ul,溶解于l胶回收试剂盒的Elusion Buffer中。 含有SV40大T抗原（2200bp）序列的PMD18T质粒，BamHI、EcoRI双酶切（产生两条带），胶回收目的带，获得线性片段大小为2200bp，浓度为10 ng/ul,溶解于l胶回收试剂盒的Elusion Buffer中. 连接反应 1、使用T4连接酶（10ul体系），50 ng线性pcDNA3.1，40ng SV40大T抗原线性片段，连接30h。转化，转化无菌落产生。 2、使用Takara TaKaRa DNA Ligation Kit LONG试剂盒，50 ng线性pcDNA3.1，50ng SV40大T抗原线性片段，1ul 试剂盒中的连接酶，连接30h，转化无菌落产生。用试剂盒中的阳性对照做有大量菌落产生。 感受态细胞DH5α，经过验证转化频率大于10^8. 请高手帮我分析一下为什么平板上没有阳性菌落产生？这个实验我做了很久了，是没有连接上？pcDNA3.1-SV40连接产物对感受态细胞DH5α有细胞毒性？还是什么原因？ 非常感谢。 |
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