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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Nde1和BamH1做双酶切，T载上测过序，现在要从T载上切下，连到表达载体PET-23a
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)

[求助] Nde1和BamH1做双酶切，T载上测过序，现在要从T载上切下，连到表达载体PET-23a

Nde1和BamH1做双酶切，T载上测过序，现在要从T载上切下，连到表达载体PET-23a，转化挑单菌落进行菌液PCR有目的条带，提质粒以质粒为模板PCR没有条带，质粒跑胶好像是空的，但是没有连接上表达载体的目的基因怎么可以扩展的……（因为每次对提质粒用的菌液进行PCR都有目的条带，阴性对照也有很浅的条带，很浅，应该不影响吧），求解释，因为下面急着做突变~~~感谢各位大神！！
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1楼 2013-09-04 16:47:05
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ivan94

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:36:39
看了你的描述，除了他们说的，我觉得还有一种可能是长得单菌落根本不是大肠杆菌，可能是杂菌，你挑了杂菌摇后PCR有杂带，提质粒更是提不出来。也就是说很可能你连接失败了。ps：你的单菌落从涂板到长出来用了多长时间？
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生如夏花，在追求绚烂的结果的同时，别忘了享受过程的美好！
14楼2013-09-06 17:21:16
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普通回帖

忽而今秋

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-05 15:02:12
你质粒提的有没有问题？

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2013-09-05 00:28:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-09-05 15:01:30
阴性对照的条带与目的条带大小相同吗？如果是，说明PCR体系污染了，问题不是已经很大了吗？
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3楼2013-09-05 01:46:53
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2008101111

金虫 (正式写手)

学术江湖混子

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-05 15:01:53
这种情况下，污染的可能性很大
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自主创业者，捣腾生物试剂
4楼2013-09-05 10:56:50
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gdmchql

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。从根本去入手 2013-09-05 15:01:39
这显然是假阳性结果，最好更换了PCR试剂，还有水经常是最可能的污染源
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5楼2013-09-05 11:26:01
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 忽而今秋 at 2013-09-05 00:28:42
你质粒提的有没有问题？

本来用的生工的，后来用OMEGA又提了一次
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6楼2013-09-05 13:34:27
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-09-05 01:46:53
阴性对照的条带与目的条带大小相同吗？如果是，说明PCR体系污染了，问题不是已经很大了吗？

大小一样大，PCR体系污染，现在只有可能是引物污染了，水是新的，Master MIX也是新的
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7楼2013-09-05 13:36:11
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 2008101111 at 2013-09-05 10:56:50
这种情况下，污染的可能性很大

恩恩
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8楼2013-09-05 13:36:24
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gdmchql at 2013-09-05 11:26:01
这显然是假阳性结果，最好更换了PCR试剂，还有水经常是最可能的污染源

都有换，可能是引物被污染了
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9楼2013-09-05 13:36:55
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爱上文慧

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
JAYWEN书生(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 11:48:25
一种可能是你pcr试剂被污染了，
另一种就是你提rna，没有提出来，你是用的试剂盒吗？
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每一个你讨厌的现在都有一个不努力的曾经
10楼2013-09-05 15:05:51
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