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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Nde1和BamH1做双酶切，T载上测过序，现在要从T载上切下，连到表达载体PET-23a
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 爱上文慧 at 2013-09-05 15:05:51
一种可能是你pcr试剂被污染了，
另一种就是你提rna，没有提出来，你是用的试剂盒吗？

是试剂盒，不是RNA，提的质粒。今天下午换了水，没有P出条带，连接在T载体上的目的基因能P出条带，就是酶切连接到表达载体上时就没条带了
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11楼2013-09-05 18:14:40
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Jaaar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 11:48:38
引用回帖:
11楼: Originally posted by JAYWEN书生 at 2013-09-05 18:14:40
是试剂盒，不是RNA，提的质粒。今天下午换了水，没有P出条带，连接在T载体上的目的基因能P出条带，就是酶切连接到表达载体上时就没条带了...

根据你之前的描述应该是存在PCR体系污染，最有可能的应该是在引物。

那么假设引物的污染不影响结果，那么还是有以下的问题需要解决的

酶切之后有跑胶确认pET载体以及带目的基因的T载体都完全反应了么？

还有就是连接的时候目的片段和载体之间的比例是否恰当？
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12楼2013-09-06 11:09:48
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by Jaaar at 2013-09-06 11:09:48
根据你之前的描述应该是存在PCR体系污染，最有可能的应该是在引物。

那么假设引物的污染不影响结果，那么还是有以下的问题需要解决的

酶切之后有跑胶确认pET载体以及带目的基因的T载体都完全反应了么？

...

酶切之后跑胶回收，回收完了，又跑胶做了验证，有目的基因和PET的条带，但是连接之后做转化，再提质粒PCR就没有了，刚才重新做的酶切，又是到提质粒PCR没有目的基因条带了，但是质粒PCR的泳道上有好多杂条带，这是为啥呢？
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13楼2013-09-06 13:48:19
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ivan94

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:36:39
看了你的描述，除了他们说的，我觉得还有一种可能是长得单菌落根本不是大肠杆菌，可能是杂菌，你挑了杂菌摇后PCR有杂带，提质粒更是提不出来。也就是说很可能你连接失败了。ps：你的单菌落从涂板到长出来用了多长时间？
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生如夏花，在追求绚烂的结果的同时，别忘了享受过程的美好！
14楼2013-09-06 17:21:16
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ivan94

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

再ps：根据实验经验，菌液PCR不靠谱，有的实际连上了也p不出来，没连上的也可能出现所谓的“目的”条带，所以连接后一定要酶切和测序，提质粒也不难，我还是觉得你挑的单菌落是杂菌的可能性大
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生如夏花，在追求绚烂的结果的同时，别忘了享受过程的美好！
15楼2013-09-06 17:26:45
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by ivan94 at 2013-09-06 17:21:16
看了你的描述，除了他们说的，我觉得还有一种可能是长得单菌落根本不是大肠杆菌，可能是杂菌，你挑了杂菌摇后PCR有杂带，提质粒更是提不出来。也就是说很可能你连接失败了。ps：你的单菌落从涂板到长出来用了多长时 ...

涂板后过夜就能长出来，菌液PCR后只有一条跟目的基因大小一样的带，就是在提质粒后PCR没有目的条带，有杂带。。然后再对质粒进行双酶切，没有目的基因…………
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16楼2013-09-06 19:28:21
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ivan94

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by JAYWEN书生 at 2013-09-06 19:28:21
涂板后过夜就能长出来，菌液PCR后只有一条跟目的基因大小一样的带，就是在提质粒后PCR没有目的条带，有杂带。。然后再对质粒进行双酶切，没有目的基因…………...

那就很可能你挑的是杂菌的点，刚好跟你目的基因大小差不多，不能说大小一样，因为2个marker条带之间也看不出精确的大小。从头重新连吧！
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生如夏花，在追求绚烂的结果的同时，别忘了享受过程的美好！
17楼2013-09-06 20:19:16
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莓林塔

木虫 (小有名气)
你菌液pcr用的是目的片段的引物么？还是载体的？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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18楼2013-09-07 11:01:49
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 莓林塔 at 2013-09-07 11:01:49
你菌液pcr用的是目的片段的引物么？还是载体的？

目的片段的！
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19楼2013-09-08 14:13:45
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by ivan94 at 2013-09-06 20:19:16
那就很可能你挑的是杂菌的点，刚好跟你目的基因大小差不多，不能说大小一样，因为2个marker条带之间也看不出精确的大小。从头重新连吧！...

恩，好的，谢了啊
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20楼2013-09-08 14:14:31
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