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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by 爱上文慧 at 2013-09-05 15:05:51
一种可能是你pcr试剂被污染了,
另一种就是你提rna,没有提出来,你是用的试剂盒吗?

是试剂盒,不是RNA,提的质粒。今天下午换了水,没有P出条带,连接在T载体上的目的基因能P出条带,就是酶切连接到表达载体上时就没条带了
11楼2013-09-05 18:14:40
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Jaaar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-09-06 11:48:38
引用回帖:
11楼: Originally posted by JAYWEN书生 at 2013-09-05 18:14:40
是试剂盒,不是RNA,提的质粒。今天下午换了水,没有P出条带,连接在T载体上的目的基因能P出条带,就是酶切连接到表达载体上时就没条带了...

根据你之前的描述应该是存在PCR体系污染,最有可能的应该是在引物。

那么假设引物的污染不影响结果,那么还是有以下的问题需要解决的

酶切之后有跑胶确认pET载体以及带目的基因的T载体都完全反应了么?

还有就是连接的时候目的片段和载体之间的比例是否恰当?
12楼2013-09-06 11:09:48
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by Jaaar at 2013-09-06 11:09:48
根据你之前的描述应该是存在PCR体系污染,最有可能的应该是在引物。

那么假设引物的污染不影响结果,那么还是有以下的问题需要解决的

酶切之后有跑胶确认pET载体以及带目的基因的T载体都完全反应了么?

...

酶切之后跑胶回收,回收完了,又跑胶做了验证,有目的基因和PET的条带,但是连接之后做转化,再提质粒PCR就没有了,刚才重新做的酶切,又是到提质粒PCR没有目的基因条带了,但是质粒PCR的泳道上有好多杂条带,这是为啥呢?
13楼2013-09-06 13:48:19
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ivan94

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-09-06 17:36:39
看了你的描述,除了他们说的,我觉得还有一种可能是长得单菌落根本不是大肠杆菌,可能是杂菌,你挑了杂菌摇后PCR有杂带,提质粒更是提不出来。也就是说很可能你连接失败了。ps:你的单菌落从涂板到长出来用了多长时间?
生如夏花,在追求绚烂的结果的同时,别忘了享受过程的美好!
14楼2013-09-06 17:21:16
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ivan94

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

再ps:根据实验经验,菌液PCR不靠谱,有的实际连上了也p不出来,没连上的也可能出现所谓的“目的”条带,所以连接后一定要酶切和测序,提质粒也不难,我还是觉得你挑的单菌落是杂菌的可能性大
生如夏花,在追求绚烂的结果的同时,别忘了享受过程的美好!
15楼2013-09-06 17:26:45
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by ivan94 at 2013-09-06 17:21:16
看了你的描述,除了他们说的,我觉得还有一种可能是长得单菌落根本不是大肠杆菌,可能是杂菌,你挑了杂菌摇后PCR有杂带,提质粒更是提不出来。也就是说很可能你连接失败了。ps:你的单菌落从涂板到长出来用了多长时 ...

涂板后过夜就能长出来,菌液PCR后只有一条跟目的基因大小一样的带,就是在提质粒后PCR没有目的条带,有杂带。。然后再对质粒进行双酶切,没有目的基因…………
16楼2013-09-06 19:28:21
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ivan94

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
16楼: Originally posted by JAYWEN书生 at 2013-09-06 19:28:21
涂板后过夜就能长出来,菌液PCR后只有一条跟目的基因大小一样的带,就是在提质粒后PCR没有目的条带,有杂带。。然后再对质粒进行双酶切,没有目的基因…………...

那就很可能你挑的是杂菌的点,刚好跟你目的基因大小差不多,不能说大小一样,因为2个marker条带之间也看不出精确的大小。从头重新连吧!
生如夏花,在追求绚烂的结果的同时,别忘了享受过程的美好!
17楼2013-09-06 20:19:16
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莓林塔

木虫 (小有名气)

你菌液pcr用的是目的片段的引物么?还是载体的?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
18楼2013-09-07 11:01:49
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)

引用回帖:
18楼: Originally posted by 莓林塔 at 2013-09-07 11:01:49
你菌液pcr用的是目的片段的引物么?还是载体的?

目的片段的!
19楼2013-09-08 14:13:45
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)

引用回帖:
17楼: Originally posted by ivan94 at 2013-09-06 20:19:16
那就很可能你挑的是杂菌的点,刚好跟你目的基因大小差不多,不能说大小一样,因为2个marker条带之间也看不出精确的大小。从头重新连吧!...

恩,好的,谢了啊
20楼2013-09-08 14:14:31
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