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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » Nde1和BamH1做双酶切，T载上测过序，现在要从T载上切下，连到表达载体PET-23a
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)

[求助] Nde1和BamH1做双酶切，T载上测过序，现在要从T载上切下，连到表达载体PET-23a

Nde1和BamH1做双酶切，T载上测过序，现在要从T载上切下，连到表达载体PET-23a，转化挑单菌落进行菌液PCR有目的条带，提质粒以质粒为模板PCR没有条带，质粒跑胶好像是空的，但是没有连接上表达载体的目的基因怎么可以扩展的……（因为每次对提质粒用的菌液进行PCR都有目的条带，阴性对照也有很浅的条带，很浅，应该不影响吧），求解释，因为下面急着做突变~~~感谢各位大神！！
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1楼 2013-09-04 16:47:05
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Jaaar

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 11:48:38
引用回帖:
11楼: Originally posted by JAYWEN书生 at 2013-09-05 18:14:40
是试剂盒，不是RNA，提的质粒。今天下午换了水，没有P出条带，连接在T载体上的目的基因能P出条带，就是酶切连接到表达载体上时就没条带了...

根据你之前的描述应该是存在PCR体系污染，最有可能的应该是在引物。

那么假设引物的污染不影响结果，那么还是有以下的问题需要解决的

酶切之后有跑胶确认pET载体以及带目的基因的T载体都完全反应了么？

还有就是连接的时候目的片段和载体之间的比例是否恰当？
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12楼2013-09-06 11:09:48
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忽而今秋

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-05 15:02:12
你质粒提的有没有问题？

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2013-09-05 00:28:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-09-05 15:01:30
阴性对照的条带与目的条带大小相同吗？如果是，说明PCR体系污染了，问题不是已经很大了吗？
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3楼2013-09-05 01:46:53
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2008101111

金虫 (正式写手)

学术江湖混子

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-05 15:01:53
这种情况下，污染的可能性很大
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自主创业者，捣腾生物试剂
4楼2013-09-05 10:56:50
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