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笀书丶

新虫 (初入文坛)

[求助] 构建的表达载体, 双酶切出现杂带,求助分析原因已有2人参与

最近在构建表达载体,构建完成后进行单双酶切鉴定, 发现自己的目的条带位置正确,但是发现存在一条杂带,无论单双酶切还是跑质粒,杂带都存在,请问是什么原因? 如图,是我挑了三个菌落后,提质粒双酶切的图, 5000maker  目的条带在545bp处

构建的表达载体, 双酶切出现杂带,求助分析原因
重组质粒双酶切鉴定.jpg
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鱼》

新虫 (正式写手)

是不是载体上还有你用的酶的酶切位点

发自小木虫Android客户端
2楼2016-11-20 15:41:17
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迷路人啊

新虫 (小有名气)

没有切开的超螺旋质粒吧?

发自小木虫IOS客户端
3楼2016-11-20 16:21:52
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笀书丶

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 鱼》 at 2016-11-20 15:41:17
是不是载体上还有你用的酶的酶切位点

不是 , 我用的Nco-BamH这两个位点, 载体上不存在这两个位点的,无论用这两种酶单切 还是双切, 杂带都存在, 跑质粒,这条带也存在。
4楼2016-11-20 17:00:03
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鱼》

新虫 (正式写手)

你用空载体跑一下对照,验证空载体污染吗

发自小木虫Android客户端
5楼2016-11-20 17:43:50
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笀书丶

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 迷路人啊 at 2016-11-20 16:21:52
没有切开的超螺旋质粒吧?

我不敢确定, 但是无论是单跑这个质粒,还是双酶切,单酶切。这个带都会存在,而且都在那个位置上, 主要我担心它会不会对我的后续实验产生影响
6楼2016-11-21 12:37:20
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迷路人啊

新虫 (小有名气)

转表达宿主在提质粒也是这样吗?

发自小木虫IOS客户端
7楼2016-11-21 13:50:36
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小冀-

版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
笀书丶: 金币+2, 有帮助 2016-11-22 10:37:24
质粒对照上如果还有的话可能就是没切开,可以换个酶试试

发自小木虫Android客户端
···
8楼2016-11-21 23:28:44
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生物狗-哈

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 笀书丶 at 2016-11-20 17:00:03
不是 , 我用的Nco-BamH这两个位点, 载体上不存在这两个位点的,无论用这两种酶单切 还是双切, 杂带都存在, 跑质粒,这条带也存在。...

可以将质粒涂下板,挑单菌落鉴定下,看下是不是有污染其他的东西。也可以试下Vazyme同源重组的方法重新构建,一天时间就可以拿到克隆了
9楼2016-12-28 15:52:58
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yangxp2006

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

更换电泳缓冲液,重新制胶。应该是电泳时带入的。。。
10楼2016-12-28 20:36:21
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