应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 长片段PCR问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
211/3返回列表123下一页
查看: 2443  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

雪之汐若

银虫 (小有名气)

[求助] 长片段PCR问题 已有4人参与

要从斑马鱼基因组DNA上扩增一个大约6K左右的片段
尝试了实验室所有的酶，Taq，KOD，KODneo……但是直接扩增均失败
有了一个新的思路，把6K分成3个2K 的片段，用Overlap PCR最后连接在一起，但是小片段扩增成功，测序也是正确的，没有办法用Overlap PCR的方式融合在一起，不知道是出了啥状况，大家都有啥好的建议。
或者说有没有相关从基因组上扩增长片段的经验，好用的酶或者Kit之类的，感激不尽，祝大家科研天天出成果@biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
因为有了我而让这个世界有一点点的不一样
1楼 2016-09-05 15:54:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

雪之汐若

银虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-06 08:22:50
引用回帖:
4楼: Originally posted by 更恋秋风 at 2016-09-05 19:08:40
6k应该是可以pcr的，如果是直接pcr可以尝试第一步的预变形时间延长到15min，酶可以试试NEB的Q5聚合酶。如果是直接分段pcr然后overlap pcr，实际上是不太容易连接的，可以试试其他连接手段，比如一步克隆。
...

我也觉得不好链接

发自小木虫IOS客户端
赞一下(2人) 回复此楼
因为有了我而让这个世界有一点点的不一样
7楼2016-09-05 21:33:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-06 22:25:57
6 kb的产物采用长片段PCR扩增试剂盒很容易扩增出来，设计引物的时候将引物设置在30bp左右
赞一下(1人) 回复此楼
rainwater
9楼2016-09-06 16:31:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

雪之汐若

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cry_2013 at 2016-09-06 13:38:23
用酶切位点连吧，虽然是老办法，但还是比较有效果的

实在不行就这样了

发自小木虫IOS客户端
赞一下(1人) 回复此楼
因为有了我而让这个世界有一点点的不一样
11楼2016-09-06 17:58:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 雪之汐若 at 2016-09-06 17:58:11
有什么好的kit吗？
...

我用过的生工生物工程（上海）股份公司的 Long and Accurate PCR Kit，以人的基因组DNA为模板，扩增过长度为15 kb的片段，扩增效果还是不错的。你可以试试。
赞一下(1人) 回复此楼
rainwater
16楼2016-09-07 14:15:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

雪之汐若

银虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-06 08:22:22
有木有人呀
回复此楼
因为有了我而让这个世界有一点点的不一样
2楼2016-09-05 17:26:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

010308Jing

木虫 (正式写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-06 08:22:31
你做overlap PCR两个两个分开做的吗？还是三个一起？

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
3楼2016-09-05 19:01:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

更恋秋风

铁杆木虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-05 22:36:43
6k应该是可以pcr的，如果是直接pcr可以尝试第一步的预变形时间延长到15min，酶可以试试NEB的Q5聚合酶。如果是直接分段pcr然后overlap pcr，实际上是不太容易连接的，可以试试其他连接手段，比如一步克隆。

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
4楼2016-09-05 19:08:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

MMCCBB

新虫 (著名写手)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-06 08:22:38
买全是金的HiFi酶试试

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
5楼2016-09-05 19:47:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

雪之汐若

银虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-06 08:22:46
引用回帖:
3楼: Originally posted by 010308Jing at 2016-09-05 19:01:17
你做overlap PCR两个两个分开做的吗？还是三个一起？

都试过，感觉很难融合在一起

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
因为有了我而让这个世界有一点点的不一样
6楼2016-09-05 21:32:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用酶切位点连吧，虽然是老办法，但还是比较有效果的
赞一下 回复此楼
8楼2016-09-06 13:38:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

雪之汐若

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhangyunjing at 2016-09-06 16:31:27
6 kb的产物采用长片段PCR扩增试剂盒很容易扩增出来，设计引物的时候将引物设置在30bp左右

有什么好的kit吗？

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
因为有了我而让这个世界有一点点的不一样
10楼2016-09-06 17:58:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 雪之汐若 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 309求调剂 +14 呆菇不是戴夫 2026-04-02 14/700 2026-04-03 09:42 by 蓝云思雨
[考研] 285求调剂 +7 AZMK 2026-04-02 8/400 2026-04-03 09:40 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿生物与医药，296分，求调剂 +3 66鹿 2026-04-03 3/150 2026-04-03 09:20 by JourneyLucky
[考研] 298分 070300求调剂 +10 zwen03 2026-04-02 10/500 2026-04-03 09:05 by 羊儿丹
[考研] 283分材料与化工求调剂 +20 罗KAKA 2026-04-02 20/1000 2026-04-03 08:32 by tianyyysss
[考研] 。 +4 雾与海 2026-04-02 5/250 2026-04-02 19:16 by 土木硕士招生
[考研] 413求调剂 +3 柯某某 2026-03-31 3/150 2026-04-02 16:59 by zzsw+
[考研] 材料专业求调剂 +10 月月鸟木 2026-04-01 10/500 2026-04-02 12:57 by wxiongid
[考研] 354求调剂 +4 lxb598 2026-03-31 5/250 2026-04-02 09:55 by Jaylen.
[考研] 材料求调剂 +10 呢呢妮妮 2026-04-01 13/650 2026-04-02 09:17 by olim
[考研] 一志愿安徽大学计算机科学与技术学硕，331分求调剂 +5 蒋昌鹏qtj 2026-04-01 5/250 2026-04-02 08:10 by fxue1114
[考研] 化学工程专硕324分，一志愿中国矿业大学求调剂 +7 耿耿1314 2026-04-01 7/350 2026-04-02 07:40 by 尚水阁主
[考研] 273求调剂 +19 李芷新1 2026-03-31 19/950 2026-04-01 21:49 by chyhaha
[考研] 一志愿西安交大材料学硕（英一数二）347，求调剂到高分子/材料相关专业 +7 zju51 2026-03-31 9/450 2026-04-01 19:35 by CFQZAFU
[考研] 一志愿南昌大学324求调剂 +7 hanamiko 2026-03-30 7/350 2026-04-01 13:22 by JourneyLucky
[考研] 329求调剂，一志愿西北工业大学，材料工程（085601） +6 小小机灵虫 2026-03-29 12/600 2026-03-31 16:58 by 记事本2026
[考研] 332求调剂 +6 @MZB382400 2026-03-28 6/300 2026-03-30 16:57 by 无际的草原
[考研] 296求调剂 +10 彼岸t 2026-03-29 10/500 2026-03-30 10:50 by 探123
[考研] 283求调剂 +3 A child 2026-03-28 3/150 2026-03-28 15:41 by ms629
[考研] 312，生物学求调剂 +3 小译同学abc 2026-03-28 3/150 2026-03-28 15:32 by 落睿可思
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭