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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 长片段PCR问题
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雪之汐若

银虫 (小有名气)

[求助] 长片段PCR问题 已有4人参与

要从斑马鱼基因组DNA上扩增一个大约6K左右的片段
尝试了实验室所有的酶，Taq，KOD，KODneo……但是直接扩增均失败
有了一个新的思路，把6K分成3个2K 的片段，用Overlap PCR最后连接在一起，但是小片段扩增成功，测序也是正确的，没有办法用Overlap PCR的方式融合在一起，不知道是出了啥状况，大家都有啥好的建议。
或者说有没有相关从基因组上扩增长片段的经验，好用的酶或者Kit之类的，感激不尽，祝大家科研天天出成果@biostar2009@飞约疯人院@wizardfan@youlinglyw
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因为有了我而让这个世界有一点点的不一样
1楼 2016-09-05 15:54:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

雪之汐若

银虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-06 08:22:50
引用回帖:
4楼: Originally posted by 更恋秋风 at 2016-09-05 19:08:40
6k应该是可以pcr的，如果是直接pcr可以尝试第一步的预变形时间延长到15min，酶可以试试NEB的Q5聚合酶。如果是直接分段pcr然后overlap pcr，实际上是不太容易连接的，可以试试其他连接手段，比如一步克隆。
...

我也觉得不好链接

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因为有了我而让这个世界有一点点的不一样
7楼2016-09-05 21:33:09
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-06 22:25:57
6 kb的产物采用长片段PCR扩增试剂盒很容易扩增出来，设计引物的时候将引物设置在30bp左右
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rainwater
9楼2016-09-06 16:31:27
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雪之汐若

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cry_2013 at 2016-09-06 13:38:23
用酶切位点连吧，虽然是老办法，但还是比较有效果的

实在不行就这样了

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因为有了我而让这个世界有一点点的不一样
11楼2016-09-06 17:58:22
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 雪之汐若 at 2016-09-06 17:58:11
有什么好的kit吗？
...

我用过的生工生物工程（上海）股份公司的 Long and Accurate PCR Kit，以人的基因组DNA为模板，扩增过长度为15 kb的片段，扩增效果还是不错的。你可以试试。
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rainwater
16楼2016-09-07 14:15:10
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普通回帖

雪之汐若

银虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-06 08:22:22
有木有人呀
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因为有了我而让这个世界有一点点的不一样
2楼2016-09-05 17:26:20
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010308Jing

木虫 (正式写手)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-06 08:22:31
你做overlap PCR两个两个分开做的吗？还是三个一起？

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3楼2016-09-05 19:01:17
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更恋秋风

铁杆木虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-09-05 22:36:43
6k应该是可以pcr的，如果是直接pcr可以尝试第一步的预变形时间延长到15min，酶可以试试NEB的Q5聚合酶。如果是直接分段pcr然后overlap pcr，实际上是不太容易连接的，可以试试其他连接手段，比如一步克隆。

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4楼2016-09-05 19:08:40
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MMCCBB

新虫 (著名写手)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-06 08:22:38
买全是金的HiFi酶试试

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5楼2016-09-05 19:47:42
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雪之汐若

银虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-06 08:22:46
引用回帖:
3楼: Originally posted by 010308Jing at 2016-09-05 19:01:17
你做overlap PCR两个两个分开做的吗？还是三个一起？

都试过，感觉很难融合在一起

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因为有了我而让这个世界有一点点的不一样
6楼2016-09-05 21:32:42
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cry_2013

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用酶切位点连吧，虽然是老办法，但还是比较有效果的
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8楼2016-09-06 13:38:23
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雪之汐若

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhangyunjing at 2016-09-06 16:31:27
6 kb的产物采用长片段PCR扩增试剂盒很容易扩增出来，设计引物的时候将引物设置在30bp左右

有什么好的kit吗？

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因为有了我而让这个世界有一点点的不一样
10楼2016-09-06 17:58:11
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