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真果粒新虫 (初入文坛)
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质粒长片段pcr及质粒的重新构建 已有2人参与
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准备在一个购买的一个质粒（12kb）加一个基因，但由于没有合适的酶切位点，所以准备先将原质粒进行全长pcr，并在引物上添加酶切位点，最后和目的基因连接构建新的质粒。但在p质粒全长的时候遇到如下图（左边两泳道）的问题。即：目的条带较暗，而点样孔里面较亮。LArtaq和primestar GXL两种酶都用过，也差不多都这样。反应条件LArtaq：95℃：5min 94℃:45s (55-68℃)： 45s 72℃：11min 72℃：10min ，primestar GXL是根据其说明书来的：（三步法）95℃：5min 98℃:10s (65℃和60℃均用过)： 15s 72℃（说明书上用的是68℃也用过）：11min(说明书上超过10kb的延伸时间为10min，也试过) ;（两步法）95℃：5min 98℃:10s 68℃：10min 68℃：10min。引物包装上给出的温度是70和72摄氏度（引物上加了酶切位点）。 各位大神，出现如图的情况是啥原因？另外，进行用上面的方法重构质粒的方法可行吗？  小木虫.jpg |
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kangaroo0513
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