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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒长片段pcr及质粒的重新构建
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真果粒

新虫 (初入文坛)

[求助] 质粒长片段pcr及质粒的重新构建 已有2人参与

准备在一个购买的一个质粒（12kb）加一个基因，但由于没有合适的酶切位点，所以准备先将原质粒进行全长pcr，并在引物上添加酶切位点，最后和目的基因连接构建新的质粒。但在p质粒全长的时候遇到如下图（左边两泳道）的问题。即：目的条带较暗，而点样孔里面较亮。LArtaq和primestar GXL两种酶都用过，也差不多都这样。反应条件LArtaq：95℃：5min    94℃:45s   (55-68℃)： 45s   72℃：11min   72℃：10min  ，primestar GXL是根据其说明书来的：（三步法）95℃：5min    98℃:10s     (65℃和60℃均用过)： 15s    72℃（说明书上用的是68℃也用过）：11min(说明书上超过10kb的延伸时间为10min，也试过) ;（两步法）95℃：5min    98℃:10s    68℃：10min   68℃：10min。引物包装上给出的温度是70和72摄氏度（引物上加了酶切位点）。
各位大神，出现如图的情况是啥原因？另外，进行用上面的方法重构质粒的方法可行吗？

质粒长片段pcr及质粒的重新构建
小木虫.jpg
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徘徊在街头，不知何去何从。
1楼 2016-02-22 13:25:02
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-02-22 22:41:56
大的质粒（>5kb）不推荐PCR扩增，谁知道在哪就突变了。。你又不可能扩增完了把整个质粒都测序了。。你看一下质粒图谱，看看两边有没有单一酶切位点（不是你要插入基因的地方，而是再上游和下游）。有的话，就做overlap PCR，插入你的酶切位点就行了。

你是慢病毒载体么？我手里有很多慢病毒载体，需要的话可以站短我。。
赞一下 回复此楼
2楼2016-02-22 15:09:13
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sunlk

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-02-22 22:42:14
没有合适的酶切位点的话 可用平末端连接的方法试试，这个可以有的；此外点样孔亮，跑不出就是可能你的质粒做模板量加的太多了，。反复的变性复性，质粒交叉在一起拉，跑不出去。50ul体系，质粒做模板10ng足够。该用平末端连接吧。
赞一下 回复此楼
很给力
3楼2016-02-22 16:24:16
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