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小李纸11银虫 (正式写手)
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重组质粒转化大肠杆菌后长出来的全部是载体自连的产物，怎么回事？ 已有1人参与
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| PCR扩增目的片段，然后纯化，连T载体，再把重组的质粒和空载体质粒酶切，纯化、连接，结果长出的克隆挑12个提取质粒，琼脂糖凝胶电泳检测发现条带大小都一样，而且PCR检测都是空载体。。。怎么回事啊，酶切的很完全啊，就算有空载也不至于这么多吧！ |
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空载体有相应抗性，肯定可以进入感受态细胞。继续挑吧，我前几天挑了几十个，结果切出相应大小片段，测序却不正确。慢慢挑 发自小木虫IOS客户端 |
2楼2016-07-15 23:27:43
梅太奇阿拉干
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3楼2016-07-16 11:10:33
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原海亮
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你的目的条带是从pcr产物+T载体上面切下来的，然后胶回收的么，如果这样的话，个人觉得片段通过这些的方式获得是最理想的，酶切回收的目的条带应该是酶切比较完全的。主要的问题是你的载体处理，你使用的空载作为出发载体，基本上对是否酶切完全是无法判断的，你可以把载体量加大，做一次二次酶切，确保载体酶切完全，当然最方便的办法，就像你处理目的条带一样，不要用空载出发，找一个实验室这个载体已经连接目的基因的重组载体，上面当然是要有你需要的位点的，以它出发做酶切，回收载体片段，你可以通过是否有小片段切除，在电泳上来判断酶切是否完全。最后连接前，把目的条带和载体片段跑电泳看看浓度，确保你最后回收到了目的片段，如果肉眼能看到条带，我个人习惯会尽可能的减少载体用量，另外你12个克隆的质粒拿出来做个双酶切看看吧。 发自小木虫Android客户端 |
5楼2016-07-17 10:39:53
小李纸11
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6楼2016-07-17 11:58:49
小李纸11
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