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wangyibo8629新虫 (初入文坛)
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重组质粒转化总是失败，请帮助分析下 已有2人参与
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重组质粒转化多次失败，请懂的老师帮助分析下原因。试验过程如下:双酶切分别得到目的基因全序列（约0.8kb）及含同样酶切位点的载体(约7kb，分别胶回收)，回收片段用T4连接酶连接，但连接之后转化大肠杆菌感受态细胞没有菌落长出，多次上述操作重复都没有菌落长出，找不到失败原因很着急，请老师帮助分析下。一开始转化长出过一次，PCR检测目的条带大小也正确，但有非特异性条带，之后再酶切连接转化检测时条带大小都不对了...酶切胶回收后片段浓度较低，载体浓度为5.5ng/ul，目的片段浓度为0.7ng/ul，连接反应体系为:载体1ul，目的片段7.5ul，连接酶0.5ul，buffer1ul。请帮看下哪里有问题，非常感谢。 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
wangyibo8629: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2015-07-31 15:43:48
感谢参与，应助指数 +1
wangyibo8629: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2015-07-31 15:43:48
| 用PCR鉴定重组质粒我个人认为不太准，还是要看酶切鉴定的结果，整个过程中首先你要确定酶切位点没有错误，必须是目标基因所不含的酶切位点，酶切位点的方向也有注意；建议连接转化时做对照组，酶切后的载体做自连接对照， 如果对照组与实验组长出的克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，建议先不要做后续验证，重新从酶切开始， 增酶量及酶切时间、 适当减少所切载体的量、改变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可继续进行后续验证，像你这种情况如果自连接对照都没有长出菌落，那可以考虑看看是否是感受态的问题 |
2楼2015-07-31 10:19:44
3楼2015-07-31 12:35:31
wangyibo8629
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wangyibo8629
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好的，谢谢董老师，我做下对照试验试一下*^_^*。因为其他同学也做相关的试验，感受态和连接酶应该都没有问题。现在我担心的是会不会酶切时产生星活性，导致酶切位点改变，影响了后继试验。做双酶切时我用的是Bam H I和Xho I，这两种酶酶切时最适温度不同，一个是30度一个是37度(30度也可以），我就都用30度了，酶切之后电泳片段大小是对的，胶回收之后再连接，之后再转化就总是不长菌落。目的片段和载体的其它序列应该都没有这两个酶切位点。但其中一个酶Xhol连接效率较低，适合平末端的反应条件，当时没注意，酶切时就选了两种酶的通用缓冲液，直接把待酶切的DNA和两种酶、缓冲液加一块反应了，不知道这一步有没有问题...我再试试，非常感谢老师帮助。 [ 发自手机版 http://muchong.com/3g ] |
4楼2015-07-31 15:42:33
5楼2015-07-31 16:22:00
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9楼2015-08-12 09:27:56
