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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 重组质粒转化总是失败，请帮助分析下
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wangyibo8629

新虫 (初入文坛)

[求助] 重组质粒转化总是失败，请帮助分析下 已有2人参与

重组质粒转化多次失败，请懂的老师帮助分析下原因。试验过程如下:双酶切分别得到目的基因全序列（约0.8kb）及含同样酶切位点的载体(约7kb，分别胶回收)，回收片段用T4连接酶连接，但连接之后转化大肠杆菌感受态细胞没有菌落长出，多次上述操作重复都没有菌落长出，找不到失败原因很着急，请老师帮助分析下。一开始转化长出过一次，PCR检测目的条带大小也正确，但有非特异性条带，之后再酶切连接转化检测时条带大小都不对了...酶切胶回收后片段浓度较低，载体浓度为5.5ng/ul，目的片段浓度为0.7ng/ul，连接反应体系为:载体1ul，目的片段7.5ul，连接酶0.5ul，buffer1ul。请帮看下哪里有问题，非常感谢。

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1楼 2015-07-30 18:45:12
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wangyibo8629: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2015-07-31 15:43:48
用PCR鉴定重组质粒我个人认为不太准，还是要看酶切鉴定的结果，整个过程中首先你要确定酶切位点没有错误，必须是目标基因所不含的酶切位点，酶切位点的方向也有注意；建议连接转化时做对照组，酶切后的载体做自连接对照， 如果对照组与实验组长出的克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，建议先不要做后续验证，重新从酶切开始， 增酶量及酶切时间、 适当减少所切载体的量、改变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可继续进行后续验证，像你这种情况如果自连接对照都没有长出菌落，那可以考虑看看是否是感受态的问题
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医学&统计学
2楼2015-07-31 10:19:44
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ppppppppp

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-07-31 21:57:44
有三点建议，第一是感受态效率问题，可以直接购买排除；第二是pcr产物双酶切，很容易切不开，建议延长酶切时间，或者先连到克隆载体上然后切载体取小片段；第三是连接酶问题，买管新的试试，据说很容易失活。
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初来乍到，请多指教
3楼2015-07-31 12:35:31
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wangyibo8629

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2015-08-03 08:23:48
回收效率太低了吧，零点几ng几乎等于没有东西吧。建议可以加大酶切体系，同时做好对照，尽量确保酶切充分，然后再连接。如果切的比较好，只要保证基因的量足够，一般都是能连上的，祝好运
...

调整了一下反应体系，今天菌落终于长出来了，可能之前还是浓度不够，试验组与空质粒转化的对照组都有，对照组数量比较多，应该是正常的结果吧，明天继续后面的试验，谢谢老师们的建议，祝大家好运
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8楼2015-08-04 15:08:31
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yuman0709

铁虫 (初入文坛)
我想问楼主，怎样改变方案的？我现在遇到的和你一样的情况，都不知道怎么办好了？求楼主的解答
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10楼2015-11-08 12:34:00
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大漠雪狼

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by MichealXia at 2015-07-31 09:22:00
老师您好，请问您一下，如果这个实验的感受态细胞没有问题，对照组载体自连接也没有长出克隆，然而实验组长出克隆但是PCR无法检测出目的基因的存在，后续实验怎么进行验证？双酶切用考虑连接方向的问题么?...

查一下，看看你使用的酶是不是同位酶。
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今天为明天而努力。
6楼2015-08-01 12:52:03
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)
回收效率太低了吧，零点几ng几乎等于没有东西吧。建议可以加大酶切体系，同时做好对照，尽量确保酶切充分，然后再连接。如果切的比较好，只要保证基因的量足够，一般都是能连上的，祝好运

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天道酬勤
7楼2015-08-03 08:23:48
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普通回帖

wangyibo8629

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 董博士 at 2015-07-31 10:19:44
用PCR鉴定重组质粒我个人认为不太准，还是要看酶切鉴定的结果，整个过程中首先你要确定酶切位点没有错误，必须是目标基因所不含的酶切位点，酶切位点的方向也有注意；建议连接转化时做对照组，酶切后的载体做自连接 ...

好的，谢谢董老师，我做下对照试验试一下*^_^*。因为其他同学也做相关的试验，感受态和连接酶应该都没有问题。现在我担心的是会不会酶切时产生星活性，导致酶切位点改变，影响了后继试验。做双酶切时我用的是Bam H I和Xho I，这两种酶酶切时最适温度不同，一个是30度一个是37度(30度也可以），我就都用30度了，酶切之后电泳片段大小是对的，胶回收之后再连接，之后再转化就总是不长菌落。目的片段和载体的其它序列应该都没有这两个酶切位点。但其中一个酶Xhol连接效率较低，适合平末端的反应条件，当时没注意，酶切时就选了两种酶的通用缓冲液，直接把待酶切的DNA和两种酶、缓冲液加一块反应了，不知道这一步有没有问题...我再试试，非常感谢老师帮助。

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4楼2015-07-31 15:42:33
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MichealXia

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 董博士 at 2015-07-31 10:19:44
用PCR鉴定重组质粒我个人认为不太准，还是要看酶切鉴定的结果，整个过程中首先你要确定酶切位点没有错误，必须是目标基因所不含的酶切位点，酶切位点的方向也有注意；建议连接转化时做对照组，酶切后的载体做自连接 ...

老师您好，请问您一下，如果这个实验的感受态细胞没有问题，对照组载体自连接也没有长出克隆，然而实验组长出克隆但是PCR无法检测出目的基因的存在，后续实验怎么进行验证？双酶切用考虑连接方向的问题么?
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5楼2015-07-31 16:22:00
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穆圣
支持
9楼2015-08-12 09:27:56
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