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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 双酶切回收问题
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307无尘

新虫 (初入文坛)

[交流] 双酶切回收问题

最近要从PMD19T上双酶切回收我的目的片段，可是跑电泳只能看到线性化的pMD19T,然后下面看不到我的目的片段，不知道是我胶配的有问题还是酶切过程有问题？

双酶切回收问题


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1楼 2016-07-06 23:52:42
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307无尘

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 鼓励发帖交流 2016-07-07 08:25:38
marker是DL2000的，我的目的片段为620左右，大约在第三跟第四之间

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2楼2016-07-06 23:54:04
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ls2046

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-07-09 08:03:00
要么是质粒不干净，要么是酶切体系没有做好。建议1）质粒小量酶切，先验证质粒质量和酶切效率（能否出现单一的目的条带），没有问题了进行2）酶切体系扩大，但也应该先跑一个小孔看看效果，因为胶回收的空比较大，跑起来不易观察。可以尝试把胶浓度提高一点，比如用1.2%，电压低一点，跑慢一点，效果可能好一些。
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一品黄山
3楼2016-07-07 08:49:00
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不爱做实验

银虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-09 08:03:10
酶切体系和时间要适合：
1.酶不要超过体系总体积的1/10
2.酶切时间一般2-2.5h基本可以酶切完全
3.可适当加大质粒的量
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4楼2016-07-07 09:08:23
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307无尘

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ls2046 at 2016-07-07 08:49:00
要么是质粒不干净，要么是酶切体系没有做好。建议1）质粒小量酶切，先验证质粒质量和酶切效率（能否出现单一的目的条带），没有问题了进行2）酶切体系扩大，但也应该先跑一个小孔看看效果，因为胶回收的空比较大，跑 ...

谢谢建议！

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5楼2016-07-07 11:08:55
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307无尘

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 不爱做实验 at 2016-07-07 09:08:23
酶切体系和时间要适合：
1.酶不要超过体系总体积的1/10
2.酶切时间一般2-2.5h基本可以酶切完全
3.可适当加大质粒的量

多谢指导！

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6楼2016-07-07 11:09:19
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曼陀罗的祈祷

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你的质粒提完后的胶图对比一下，如果跟这个一样，那可能就是酶的问题，或者体系，你切到中间的时候有没有电泳检查一下酶切效果
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想做个有趣的人，却在逗比的道路上越走越远~
7楼2016-07-08 09:46:06
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zyfskj

新虫 (著名写手)
没切开

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向我乞求怜悯吧，我会狠狠拒绝的。
8楼2016-07-08 13:06:54
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feierorange

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
应该是没有切开，点胶的时候可以带个质粒对照看一下。另外，双酶切两种酶所用的buffer和酶切时间是否一致，可以看下。
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9楼2016-07-08 15:33:51
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凯伦爱佳佳

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
根据酶选择最适合的buffer，要保证时间3到4小时能切开

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10楼2016-07-09 01:28:03
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