| 查看: 7535 | 回复: 2 | ||
weining1203新虫 (小有名气)
|
[求助]
双酶切质粒浓度问题
|
| 小弟最近要做双酶切质粒，然后连接（将目的基因和表达载体连接），做原核表达，分别提取表达载体pET-28a质粒，使用5ml菌液，浓度为50ng/ul; pMD-19T-目的基因质粒，使用5ml菌液，浓度为150ng/ul; 我想知道的是，分别对着两种质粒进行双酶切，然后胶回收目的产物，做连接，那么这两种质粒的浓度够不够啊？还有双酶切体系怎么确定？ |
回复此楼» 猜你喜欢
莫那利珠单抗阻断NKG2A/HLA-E抑制通路 | Biochempartner
已经有0人回复
-
GSPT1口服分子胶降解剂MRT-2359 | Biochempartner
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有151人回复
-
碳青霉烯类抗生素为何需联用西司他丁钠？ | Biochempartner
已经有0人回复
-
源自蕨类植物的抗炎美白活性分子去甲氧基荚果蕨素 | Biochempartner
已经有0人回复
-
肠道里的"代谢开关"：Fexaramine用肠道限制性重新定义 FXR 激动剂
已经有0人回复
-
DMXAA：从血管破坏剂到STING通路研究的关键工具分子 | Biochempartner
已经有0人回复
-
靶向PD-L1的人源化单克隆抗体阿特珠单抗
已经有0人回复
-
"探针之父"(+)-JQ-1如何改变表观遗传研究 | Biochempartner
已经有0人回复
-
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 请问Not I的酶切效率怎样，过夜酶切都没切开！！
已经有17人回复
- PET-32a双酶切无法回收
已经有8人回复
- 双酶切粘性末端连接不上
已经有21人回复
- 酶切问题
已经有11人回复
- 双酶切问题
已经有15人回复
- 质粒双酶切问题
已经有16人回复
- 重组质粒双酶切问题
已经有5人回复
- 【求助/交流】质粒双酶切，看图！
已经有6人回复
- 【求助/交流】双酶切质粒后，目的条带浅且前方有模糊亮带
已经有12人回复
酶切专家
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 2
- 应助: 96 (初中生)
- 金币: 1610.8
- 红花: 4
- 帖子: 149
- 在线: 41.3小时
- 虫号: 1648414
- 注册: 2012-02-27
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
weining1203: 金币+5, ★有帮助 2012-11-09 20:25:57
感谢参与，应助指数 +1
weining1203: 金币+5, ★有帮助 2012-11-09 20:25:57
|
一般普通的克隆：设计连接反应时（10ul)，一般50-100ng回收的酶切后载体DNA就足够了，而回收的酶切后的目的基因片段的分子数（摩尔数）为载体的分子的3-5倍。基于以上原则，一般载体酶切时需要1-2ugDNA,，考虑到回收的效率一般在50%左右，你一般可以得到0.5-1ugDNA,而回收时洗脱体积一般至少为25ul，因而你回收的载体样品一般浓度为20-40ng/ul,这样设计10ul的连接时，你可以考虑用2-4ul回收的载体。利用类似的方法，根据你需要回收的目的基因片段的大小以及克隆目的基因载体pMD-19T的大小，可以推算出pMD-19T酶切时的用量（取决于你目的基因的大小，目的基因越小，你需要的载体DNA越多些）。 至于双酶切的设计，你可以利用double digestion designer进行设计，如果你知道了需要进行酶切的质粒DNA的量和分子大小，你就可以精确计算出完全酶切所需要的酶量，使用还用很方便的，而且可以免费使用。该软件的网址是http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
weining12032楼2012-10-23 20:36:33
weining1203
新虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 9.9
- 散金: 5
- 帖子: 132
- 在线: 36.4小时
- 虫号: 1728956
- 注册: 2012-03-31
- 专业: 植物遗传学
3楼2012-10-23 21:35:50