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weining1203新虫 (小有名气)
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双酶切质粒浓度问题
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| 小弟最近要做双酶切质粒，然后连接（将目的基因和表达载体连接），做原核表达，分别提取表达载体pET-28a质粒，使用5ml菌液，浓度为50ng/ul; pMD-19T-目的基因质粒，使用5ml菌液，浓度为150ng/ul; 我想知道的是，分别对着两种质粒进行双酶切，然后胶回收目的产物，做连接，那么这两种质粒的浓度够不够啊？还有双酶切体系怎么确定？ |
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酶切专家
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【答案】应助回帖
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一般普通的克隆：设计连接反应时（10ul)，一般50-100ng回收的酶切后载体DNA就足够了，而回收的酶切后的目的基因片段的分子数（摩尔数）为载体的分子的3-5倍。基于以上原则，一般载体酶切时需要1-2ugDNA,，考虑到回收的效率一般在50%左右，你一般可以得到0.5-1ugDNA,而回收时洗脱体积一般至少为25ul，因而你回收的载体样品一般浓度为20-40ng/ul,这样设计10ul的连接时，你可以考虑用2-4ul回收的载体。利用类似的方法，根据你需要回收的目的基因片段的大小以及克隆目的基因载体pMD-19T的大小，可以推算出pMD-19T酶切时的用量（取决于你目的基因的大小，目的基因越小，你需要的载体DNA越多些）。 至于双酶切的设计，你可以利用double digestion designer进行设计，如果你知道了需要进行酶切的质粒DNA的量和分子大小，你就可以精确计算出完全酶切所需要的酶量，使用还用很方便的，而且可以免费使用。该软件的网址是http://www.bioinfomatics.cn/enzyme/login.php |
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weining12032楼2012-10-23 20:36:33
weining1203
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