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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » His标签蛋白纯化的问题
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养鸡专业户

新虫 (初入文坛)

[求助] His标签蛋白纯化的问题 已有4人参与

我的目的蛋白在40多，用的是pet-32a载体，诱导时间一般在五个小时左右。上清和包涵体都有表达，但是上清纯化出来多一个条带，而且蛋白并不纯，包涵体纯化多出来的那个条带不是那么明显。

His标签蛋白纯化的问题


His标签蛋白纯化的问题-1


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1楼 2016-05-17 11:16:12
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miega

银虫 (小有名气)
楼主的图跑的太好了，请问用多少菌液点样量是多少？

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10楼2016-05-27 01:06:44
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养鸡专业户

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hc-material at 2016-05-18 16:53:02
看电泳图，是可溶性表达啊，然后破碎是否彻底。
纯化出来不纯有各种原因：
1.柱子没平衡好。增加平衡的时间。
2.柱填料有问题换新的。
3.洗脱拉咪唑梯度太大，可以拉梯度更细一些。
4.非特异性吸附多，平衡缓冲 ...

我用的碧云天的纯化试剂盒。请问下那个较小的带是不是标签掉了还是什么别的原因么？

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8楼2016-05-21 20:50:42
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030Selma

金虫 (正式写手)
可溶蛋白非特异吸附，所以上清中多一些，包涵体少一些

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2楼2016-05-17 11:48:27
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弘伟

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
也许把第一次纯化出来的蛋白再过一次柱子，纯度会好一些，第二条比较亮的带有没有可能是由于这个蛋白有降解呀。
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3楼2016-05-17 12:25:45
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周军威66

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我跟你的目的蛋白差不多，能挂上柱但是洗不下来，换了不同浓度的咪唑缓冲液还是不行。我的目的蛋白与上两届的师姐属于同一家族，她的就可以，我的就是不行，不知道为什么，求助！！！！！！！
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研究生，游泳，羽球。
4楼2016-05-17 17:01:46
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看电泳图，是可溶性表达啊，然后破碎是否彻底。
纯化出来不纯有各种原因：
1.柱子没平衡好。增加平衡的时间。
2.柱填料有问题换新的。
3.洗脱拉咪唑梯度太大，可以拉梯度更细一些。
4.非特异性吸附多，平衡缓冲液中加20mM的咪唑和400mM的氯化钠减少非特异性吸附。
祝顺利
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5楼2016-05-18 16:53:02
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harry007

新虫 (小有名气)
二聚体？

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6楼2016-05-20 06:17:20
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养鸡专业户

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 弘伟 at 2016-05-17 12:25:45
也许把第一次纯化出来的蛋白再过一次柱子，纯度会好一些，第二条比较亮的带有没有可能是由于这个蛋白有降解呀。

也怀疑过是降解，后来加了蛋白酶抑制剂还是没有好转

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7楼2016-05-21 20:48:29
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lxf64210785

铜虫 (小有名气)
不知道有没有试过减少挂住时间，加快洗脱速度

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9楼2016-05-21 22:07:10
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