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[求助]
蛋白纯化
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本菜鸟纯化蛋白几个月，仍然没有什么进展，求帮忙指导！！ 我觉得我的问题很多 首先我的蛋白一种 水解酶，试了很多载体，只有pMAL-C2X载体是上清和沉淀有试了其他有HIS，GST标签，都为沉淀。在MBP纯化的时候，上清、沉淀都有表达。超声破碎，离心，取上清。用12ml注射器纯化出来的蛋白没有活性(1、约2ml填料，自然静置，10ml水、15mlbuffer,依次平衡，流速约3秒1滴 2、15ml样品，静置30分钟，后流出，10秒1滴（上两遍） 3、 35ml buffer洗涤 约3秒1滴 4、5ml 洗脱buffer 静置1h，10秒1滴，5ml 静置20min，接10ml 5 用超滤管浓缩，更换醋酸钠缓冲液除盐 6、测酶活 ）buffer（20mM Tris-hcl 250mM Nacl 1mM EDTA) 在4° 冰箱里操作 蛋白失活 ，挂柱很少，不知道问题出在哪里？？ 第二种方法 用50ml离心管 ，加4ml 填料，1、加5ml纯水 3500g/5min (下同）两遍 2、5ml buffer 离心 2遍 3 加5ml样品静置10min 离心，重复3遍 4、5ml buffer 洗脱 5遍 5、洗脱buffer 5ml,静置1h,离心收集，重复两次，每次静置10min 6,、制样跑胶 （这种浓缩的蛋白有活性） SDS跑胶 结果：1、流穿液还有很多目的蛋白（结合率非常低）2、浓缩后，杂带有6条，目的条带非常弱（这让我没有信心在过分子筛的柱子，标签蛋白很多（蛋白自身降解了）两种方法加DTT效果都不明显 现在在C末端加了6个HIS，双标签，才做一次，感觉MBP的结合还是很低，若先过镍柱（重力柱），结合率提高，但是蛋白结合率还是很少。 求各位指导指导，我不知道问题出在哪，第一步纯化都做不好，更别谈后面的结晶了………… |
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