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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2026级博士研究生招生报考通知(长期有效)
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xianglixie3

铜虫 (小有名气)

[求助] primerstar PCR没有条带是为什么呢?已有3人参与

如题,我用Cdna 扩增表达片段大概2000-3000bp。
Cdna 没有问题,扩增了tub 有带。
我用Taq 酶扩增的时候有带,因为不是高保真的酶所以我想用primerstar 获得片段
试过加了6%DMSO  试过 降低退火温度 本来的退火温度是67 降到了62 还是没有条带
延伸时间用的2-3min
求解!
我都整了一个月了 没有带呀 要死要活的。
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310013

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2016-03-19 08:50:50
Takara PrimeSTAR HS DNA Polymerase?我也用这个,效果不错。无需预变性及最后延伸这两步,直接进行循环。不过退火时间与退火温度有关,你按说明书来操作。它的延伸效率是 1kb/min。祝实验顺利
7楼2016-03-18 12:06:05
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
xianglixie3: 金币+5, ★★★很有帮助, 终于扩出来了 回收之后也超级亮 谢谢 2016-03-19 08:06:38
cDNA扩增长片段是有各种问题的,模板质量得好,浓度合适;选用合适的酶;引物质量合格,高保真酶是应该用高退火的,你可以按照酶的说明书试验一下,扩增效率2000bp/min吧?不用那么长时间。
2楼2016-03-18 09:46:30
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xianglixie3

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-18 09:46:30
cDNA扩增长片段是有各种问题的,模板质量得好,浓度合适;选用合适的酶;引物质量合格,高保真酶是应该用高退火的,你可以按照酶的说明书试验一下,扩增效率2000bp/min吧?不用那么长时间。

你的意思说 它的退火温度应该比普通酶高是吗
我找找说明书重新看看 然后延伸时间降一些 再做一次
3楼2016-03-18 09:53:24
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卡维斯

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by xianglixie3 at 2016-03-18 09:53:24
你的意思说 它的退火温度应该比普通酶高是吗
我找找说明书重新看看 然后延伸时间降一些 再做一次...

对,仔细研究下说明书按他说的就可以,加油
4楼2016-03-18 09:58:53
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xianglixie3

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-18 09:58:53
对,仔细研究下说明书按他说的就可以,加油...

我还想问问  我看了说明书了  它98℃ 10sec   55℃   5sec   72℃  10sec/kb     30个循环      他没有普通pcr 前面还94度 一下 什么的 就直接循环吗、
5楼2016-03-18 10:20:24
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王爱沫1

禁虫 (小有名气)

感谢参与,应助指数 +1
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6楼2016-03-18 11:24:32
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xianglixie3

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 310013 at 2016-03-18 12:06:05
Takara PrimeSTAR HS DNA Polymerase?我也用这个,效果不错。无需预变性及最后延伸这两步,直接进行循环。不过退火时间与退火温度有关,你按说明书来操作。它的延伸效率是 1kb/min。祝实验顺利

我上午直接循环做了一下 正在电泳 谢谢
8楼2016-03-18 14:28:13
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western_99

捐助贵宾 (小有名气)


联系我吧,我们可以帮你做
9楼2016-03-18 15:31:56
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xianglixie3

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 310013 at 2016-03-18 12:06:05
Takara PrimeSTAR HS DNA Polymerase?我也用这个,效果不错。无需预变性及最后延伸这两步,直接进行循环。不过退火时间与退火温度有关,你按说明书来操作。它的延伸效率是 1kb/min。祝实验顺利

谢谢 我做出来了
10楼2016-03-19 08:07:15
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