该怎么理解胞内酶和胞外酶?高速离心能让大肠杆菌细胞破裂吗?
小虫是学材料的,最近在做关于大肠杆菌的实验,但对生物一窍不通,因此请教几个问题。
我的实验过程如下:在含乳糖的培养基中培养大肠杆菌,目的是诱导大肠杆菌产生β-半乳糖苷酶。随后离心(转速5000),用NaCl溶液清洗菌体,再离心(转速7000),然后用PBS溶液清洗菌体沉淀,得到菌体浊液。然后再往菌体浊液中加入ONPG,ONPG是β-半乳糖苷酶的底物。论文上说,对于大肠杆菌,β-半乳糖苷酶是胞内酶。但在离心分离之后,我往菌液中加入ONPG,溶液很快就变成黄色了。
所以很困惑:既然β-半乳糖苷酶是胞内酶,为什么ONPG很快就水解了呢?难道是β-半乳糖苷酶能被大肠杆菌很快释放到溶液中?或者离心能使大肠杆菌细胞破裂,β-半乳糖苷酶被释放出来?
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即便是胞内酶,在诱导过程中也会被少量的释放,
菌体细胞的破坏死亡也会使得胞内酶释放。
若是冷冻高速离心的话,也会多少破坏细胞结构。
再有PBS多少也有改变细胞通透性的作用。
而且可能跟你的酶活也有关。
个人意见,权当参考吧。
好的,谢谢您!
这个是生化书上最经典的知识啊,乳糖操纵子啊。
LacZ基因--合成半乳糖苷酶
LacY基因--合成通透酶
LacA基因--合成乙酰基转移酶
三个酶,其中起作用的是半乳糖苷酶,通透酶可以将半乳糖苷酶转移到胞外。
当然,胞内酶也可以少量释放到胞外,这个在研制大肠杆菌培养基的时候仔细研究过,呵呵
好的,谢谢您。以后多多请教您
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底物应该是是进入胞内了。楼主制备半乳糖苷酶是为了生产低聚半乳糖吗?
不是,我是想制备微生物传感器。但我看到文献上说ONPG透过细胞的能力是很弱的,见Journal of Microbiological Methods35 (1999) 207– 218
之前我们用酵母菌制备半乳糖苷酶(胞内酶),也出现您提到的现象,但酶确实在胞内。