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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 该怎么理解胞内酶和胞外酶？高速离心能让大肠杆菌细胞破裂吗？
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xiaoganghehe

铜虫 (著名写手)

[求助] 该怎么理解胞内酶和胞外酶？高速离心能让大肠杆菌细胞破裂吗？

小虫是学材料的，最近在做关于大肠杆菌的实验，但对生物一窍不通，因此请教几个问题。
        我的实验过程如下：在含乳糖的培养基中培养大肠杆菌，目的是诱导大肠杆菌产生β－半乳糖苷酶。随后离心（转速5000），用NaCl溶液清洗菌体，再离心（转速7000），然后用PBS溶液清洗菌体沉淀，得到菌体浊液。然后再往菌体浊液中加入ONPG，ONPG是β－半乳糖苷酶的底物。论文上说，对于大肠杆菌，β－半乳糖苷酶是胞内酶。但在离心分离之后，我往菌液中加入ONPG，溶液很快就变成黄色了。
        所以很困惑：既然β－半乳糖苷酶是胞内酶，为什么ONPG很快就水解了呢？难道是β－半乳糖苷酶能被大肠杆菌很快释放到溶液中？或者离心能使大肠杆菌细胞破裂，β－半乳糖苷酶被释放出来？
       希望能听听高人的意见，能给出意见和建议最好！
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相信未来，热爱生命！
1楼 2013-08-23 15:52:06
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

mizhoulong

木虫 (著名写手)

环境卫生、微生物学

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiaoganghehe: 金币+4, ★★★很有帮助, 挺好的 2013-08-26 15:01:31
这个是生化书上最经典的知识啊，乳糖操纵子啊。

LacZ基因--合成半乳糖苷酶
LacY基因--合成通透酶
LacA基因--合成乙酰基转移酶

三个酶，其中起作用的是半乳糖苷酶，通透酶可以将半乳糖苷酶转移到胞外。
当然，胞内酶也可以少量释放到胞外，这个在研制大肠杆菌培养基的时候仔细研究过，呵呵
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环境卫生、微生物学、卫生应急
4楼2013-08-26 08:40:53
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普通回帖

wmwnyxt

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiaoganghehe: 金币+1, ★★★很有帮助, 有帮助 2013-08-23 20:57:30
laozuzunzhe: 金币+3, good！ 2013-08-24 08:34:28
即便是胞内酶，在诱导过程中也会被少量的释放，
菌体细胞的破坏死亡也会使得胞内酶释放。
若是冷冻高速离心的话，也会多少破坏细胞结构。
再有PBS多少也有改变细胞通透性的作用。
而且可能跟你的酶活也有关。
个人意见，权当参考吧。
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Ifyouwanttocatchupwiththepaceoflife,youshouldfullfillyourselfatfirst
2楼2013-08-23 20:36:06
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xiaoganghehe

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wmwnyxt at 2013-08-23 20:36:06
即便是胞内酶，在诱导过程中也会被少量的释放，
菌体细胞的破坏死亡也会使得胞内酶释放。
若是冷冻高速离心的话，也会多少破坏细胞结构。
再有PBS多少也有改变细胞通透性的作用。
而且可能跟你的酶活也有关。
...

好的，谢谢您！
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相信未来，热爱生命！
3楼2013-08-23 20:57:42
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xiaoganghehe

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mizhoulong at 2013-08-26 08:40:53
这个是生化书上最经典的知识啊，乳糖操纵子啊。

LacZ基因--合成半乳糖苷酶
LacY基因--合成通透酶
LacA基因--合成乙酰基转移酶

三个酶，其中起作用的是半乳糖苷酶，通透酶可以将半乳糖苷酶转移到胞外。
当然 ...

好的，谢谢您。以后多多请教您！
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相信未来，热爱生命！
5楼2013-08-26 15:04:16
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bigboy2050

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
xiaoganghehe: 金币+3, ★有帮助 2013-08-28 21:07:17
底物应该是是进入胞内了。楼主制备半乳糖苷酶是为了生产低聚半乳糖吗？
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职业无分贵贱，做事要有格调
6楼2013-08-28 16:22:17
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xiaoganghehe

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bigboy2050 at 2013-08-28 16:22:17
底物应该是是进入胞内了。楼主制备半乳糖苷酶是为了生产低聚半乳糖吗？

不是，我是想制备微生物传感器。但我看到文献上说ONPG透过细胞的能力是很弱的，见Journal of Microbiological Methods35 (1999) 207– 218
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7楼2013-08-28 21:06:47
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bigboy2050

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by xiaoganghehe at 2013-08-28 21:06:47
不是，我是想制备微生物传感器。但我看到文献上说ONPG透过细胞的能力是很弱的，见Journal of Microbiological Methods35 (1999) 207– 218...

之前我们用酵母菌制备半乳糖苷酶（胞内酶），也出现您提到的现象，但酶确实在胞内。
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职业无分贵贱，做事要有格调
8楼2013-08-29 08:58:03
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xiaoganghehe

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by bigboy2050 at 2013-08-29 08:58:03
之前我们用酵母菌制备半乳糖苷酶（胞内酶），也出现您提到的现象，但酶确实在胞内。...

那究竟该怎么解释呢？难道真的是ONPG进入细胞内了？并且我们用葡糖糖进行培养，也出现了同样的情况。文献上说在有葡萄糖存在的条件下，半乳糖苷酶是不会被表达的
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9楼2013-08-29 09:12:12
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bigboy2050

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by xiaoganghehe at 2013-08-29 09:12:12
那究竟该怎么解释呢？难道真的是ONPG进入细胞内了？并且我们用葡糖糖进行培养，也出现了同样的情况。文献上说在有葡萄糖存在的条件下，半乳糖苷酶是不会被表达的...

底物没问题吧，ONPG容易分解。
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职业无分贵贱，做事要有格调
10楼2013-08-29 14:40:08
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