我的引物的退火温度？
上引CATGCCATGGCACATACTGTGTCGCCTGTGAAT
下引CCGCTCGAGGCGACCTTCGATTTCAACGATTGGCGTTAAAG
红色部分是我引物序列 ，其他的是保护碱基和酶切位点还有Xa识别位点，这么长引物的退火温度怎么算？
大家做PCR时退火温度有60 70度的吗？有很低的吗？想35到45度的？
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我的一个引物有59个碱基，在英俊合成的，它给了个Tm，减五度扩不好，后来直接用62度扩出来了
如果引物长度小于20 可以用Tm= 4（G+C）+2（A+T）计算，大于20的话，最好用软件看一下如priem5.0，
你可以试试55左右,primer5.0 算得退火温度是44.3度