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wuweina

金虫 (小有名气)

[交流] 我的引物的退火温度?

上引CATGCCATGGCACATACTGTGTCGCCTGTGAAT
下引CCGCTCGAGGCGACCTTCGATTTCAACGATTGGCGTTAAAG
红色部分是我引物序列 ,其他的是保护碱基和酶切位点还有Xa识别位点,这么长引物的退火温度怎么算?
大家做PCR时退火温度有60 70度的吗?有很低的吗?想35到45度的?
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xujian568

至尊木虫 (著名写手)

Count XU

按公式Tm= 4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
活着就要让人感受到你的存在。
2楼2007-12-05 15:34:38
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asr

荣誉版主 (知名作家)

很多软件都可以计算Tm值。
另外,上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃,长度相差最好不超过4bp.
思想极度邪恶,勿怕勿怪!\(^o^)/~
3楼2007-12-05 21:21:54
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asr

荣誉版主 (知名作家)

以前用过一个在线计算Tm的软件,

找到了,呵呵

http://www.bbioo.com/bio101/2007/8794.htm

[ Last edited by asr on 2007-12-6 at 18:58 ]
思想极度邪恶,勿怕勿怪!\(^o^)/~
4楼2007-12-05 21:27:05
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wuweina

金虫 (小有名气)

谢谢大家的关注!
我再试试35~45度的退火温度,还是P不出来,我就推断是引物出问题了,生工合成长引物的出错率真够高的!气死我了,就合成三条引物,都错了两次了,这次还有一条可能还有问题!气人啊!
5楼2007-12-05 23:01:52
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随风而过

银虫 (小有名气)

用别的地方合成的吧,用Promega或Invitrogen合成的引物试试,都非常不错!
6楼2007-12-06 09:06:48
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hmphoenix

试试升温PCR把,也许好用
7楼2007-12-06 10:10:45
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haono001

引用回帖:
Originally posted by wuweina at 2007-12-5 11:40:
上引CATGCCATGGCACATACTGTGTCGCCTGTGAAT
下引CCGCTCGAGGCGACCTTCGATTTCAACGATTGGCGTTAAAG
红色部分是我引物序列 ,其他的是保护碱基 ...

用60多应该没有问题的
8楼2007-12-06 13:47:16
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lbzx

金虫 (正式写手)

我的一个引物有59个碱基,在英俊合成的,它给了个Tm,减五度扩不好,后来直接用62度扩出来了
9楼2007-12-06 16:46:23
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fanxinying6042

银虫 (小有名气)

如果引物长度小于20 可以用Tm= 4(G+C)+2(A+T)计算,大于20的话,最好用软件看一下如priem5.0
10楼2007-12-06 20:29:13
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