按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

很多软件都可以计算Tm值。
另外,上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃,长度相差最好不超过4bp.

以前用过一个在线计算Tm的软件，

找到了，呵呵

http://www.bbioo.com/bio101/2007/8794.htm

[ Last edited by asr on 2007-12-6 at 18:58 ]

谢谢大家的关注！
我再试试35～45度的退火温度，还是P不出来，我就推断是引物出问题了，生工合成长引物的出错率真够高的！气死我了，就合成三条引物，都错了两次了，这次还有一条可能还有问题！气人啊！

用别的地方合成的吧，用Promega或Invitrogen合成的引物试试，都非常不错！

试试升温PCR把，也许好用