蛋白质组分中苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸三种氨基酸含有苯环共轭双键，在紫外区有光吸收，最大光吸收值在280nm左右。其中色氨酸对紫外光吸收能力最强，最大吸收波长为280nm，其次是酪氨酸为275nm,而苯丙氨酸为257nm。因此利用蛋白纯化仪进行蛋白质的纯化时，结合层析柱，测定样品在280nm下的紫外吸光值， 可进行蛋白质的纯化。

离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代，出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代，离子交换层析进入生物化学领域，应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。

基本原理

离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。

其中R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，X- 和X+ 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，Y+ 和Y- 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，A+ 和A- 分别代表溶液中的离子基团。

从上面的反应式中可以看出，如果A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子，或者提高A离子的浓度，或者通过改变其它一些条件，可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。也就是说，在一定条件下，溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来，并通过电荷基团结合到固定相上，而平衡离子则进入流动相，这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应，就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。

可利用 蛋白纯化仪 UEV 25D 对蛋白粗提液进行纯化。

下面以阴离子交换柱层析为例简单介绍纯化过程。

阴离子交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。
加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应，而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。
通过选择合适的洗脱方式和洗脱液，如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加，洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换，而将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来，而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来，从而达到分离目的。


在方法库中可设置纯化过程的方法步骤，首先设置步骤进行柱平衡，待柱子平衡好后可开始上样，不能与离子交换剂结合的正电基团和中性基团，随流动相流出而被去除。而负电基团此时已经结合到离子交换剂上。在洗脱过程中，检测样品在280nm下的吸收峰。可设置不同组分洗脱液的浓度梯度，随着含盐流动相的流入纯化仪的百分比，带不同电荷数的蛋白质陆续被洗脱，洗脱峰图实时反馈于软件中，后续可利用电泳或质谱等检测手段对洗脱后的蛋白质进行验证。


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