各位虫友你们好，我是研二的学渣一枚，我想求助一个小鼠肾脏组织石蜡包埋到切片后HE染色的问题，由于实验需要，我在其他实验室学习了从组织制作石蜡切片到HE染色的过程，后回到我们自己的实验室，因为导师让用实验室内的实验试剂，所以导师就在我学会的实验操作基础上改动了下实验方案；可是两个月来按照新的实验方案一直没能做出让导师和我满意的组织切片，实验也因此迟迟没有进展，现在在小木虫向各位虫友求助，希望能够得到大家的帮助，倘若解决问题，感激不尽！
我的实验操作流程大体如下：
石蜡组织包埋及切片制作

一、试剂：

4%多聚甲醛、无水乙醇、95%乙醇、伊红、苏木素、甘油明胶、58℃熔点石蜡、二甲苯、双蒸水。

二、耗材：

载玻片、盖玻片、滤纸、称量瓶、包埋盒、包埋底模、玻璃吸管、刀片、玻片盒、金属移片盘、细头毛笔、锯条、切片刀、玻璃棒、细针、染色缸、100ml容量瓶。

三、仪器设备：

分析天平、烘箱、手摇式生物组织切片机、生物组织烤片机、显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、4oC冰箱。

四、制作步骤
1.取材
      应尽可能采取术后新鲜组织材料。（注：如时间稍久可发生组织自溶现象）。
2.固定
      <2mm2厚度的组织块立即浸入4%多聚甲醛固定液6h，4oC（固定液与组织块的体积比为20:1）。
3.浸洗与保存
用1xPBS溶液浸泡固定后的组织块12h，多次置换固定液。
4.脱水
      组织块依次浸入70%->85%->95%->无水乙醇，（脱水)，各30min,每步2遍（应置于摇床振荡）。
5.透明
  组织块浸入二甲苯（脱乙醇，避免组织因失水过度而出现收缩与变形），30min,2遍（置于摇床振荡）。
    6.浸蜡
  将2个装有干净已融石蜡的称量瓶，置58oC烘箱。先用吸水纸吸去多余透明剂，将组织块移入第一杯石蜡中，30min后再将组织块转入第二杯蜡中继续浸蜡1.5h。
    7.包埋
  使用世泰TB-718L生物组织自动包埋机对组织进行包埋:将足量石蜡倒入融蜡缸中，提前两小时打开包埋机设置融蜡温度60℃（融蜡温度比蜡的熔点高两度即可）待包埋机温度稳定，组织脱水透明完成可将组织置于包埋盒里放入包埋盒台上踩下脚动流蜡开关进行包埋。
    8.切片
蜡块安装到包埋底模：将完全凝固的蜡块从包埋盒中取出（自制包埋盒可回收），取钢锯条在酒精灯上加热，加热后放在蜡块与包埋底模之间，充分接触后迅速移除锯片，让蜡块与底座紧密接触，冷却后开始修蜡。
修蜡原则：在组织块四周剩留小部分石蜡，尽量能肉眼观察到清晰组织大概距离蜡块边缘1mm左右（如若组织在包埋过程中不平整，可沿着组织的朝上面平行修整）。
切片原则：先将与底座粘好的组织固定在切片机上，取切片机刀片用酒精擦净残余蜡，固定于切片机上，将修好的蜡块中的组织的平面调整到与切片机刀片平行，再固定好各个部位。最开始切出的废蜡片需清除，等到切出组织部分在开始收集蜡片，切时需注意调整切面状态（有卷起来的要用毛笔卷开），防止切面断裂。通常切片厚度为3m。（切下蜡片时需用毛笔慢慢将蜡片从尾端开始一直到首段卷起从而切断，每次切断蜡片后要用毛笔将切片机刀片上残余蜡面清理干净，如若出现切面上组织裂开现象可将刀片位置调整或将蜡座调整位置）。
9.展片和贴片
      视蜡的熔点设定展片温度，以让蜡片充分展开为宜，一般取39-42oC水温（视蜡的熔点而定），摊片机使用前要保证机器中的水干净，防止污染切片。先将切下的蜡片断成适当长度，将其反光面用毛笔摊到水面（反光面与水面接触），摊至整个蜡片摊开，整个平面状态均衡舒展，没有明显的黄线，勿摊片过久，会使蜡片毁坏。捞片时，取干净的玻片放入水中，选择蜡片的一端先贴上，然后迅速垂直从水中取出，保证蜡片均匀覆盖在玻片上且蜡片底面（主要是组织片）稳稳黏附在玻片上。可根据蜡片宽度和实验设计决定在玻片上放置的蜡片数。
    10.烤片
将玻片置于60oC的烘箱中2h（让水分完全蒸发，可用针将玻片上的气泡刺破再烤）。

制作的切片 效果如下：
我焦距调整的不佳，但总感觉 切片是糊的，拍摄不清楚，很苦恼，真的很有挫败感，百思不得其解···


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