【求助/交流】荧光定量PCR？
我做的荧光定量PCR,现在存在以下几个问题：
1、熔出曲线出峰的位置有点小，在78.5的位置上，我看好多文献上多都在85左右，我想问问：我这个是我的主峰嘛?会不会是引物二聚体，或者是比较小的非特异扩增啊？（我把跑出来的样品点板，我的产物163bp，和阴性对比，我也看不出来是不是我要的产物）
2、阴性也超高，所以我怀疑是不是我P出来的不是我要的产物啊？
3、其次就是做的标准曲线，分不开，低浓度的基本上都是同时出峰，这是什么原因引起的？
如下图：
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眼看帖子沉了，帮顶
没做过 想做 路过
从你的溶解曲线看，引物的特异性不太好；
还有你的样品浓度太高，起峰在15-20个循环最好
你说你阴性超高是什么意思，是阴性也有扩增么，还有，如果你低浓度的也分不开，再加上你说的假阳性，那我可以肯定你是污染了
我现在觉得不像是污染了，感觉好像是引物二聚体和产物分不开；或者是压根就是引物二聚体。这就是上面图里的阴性
，
先做个普通pcr电泳看看扩增条带咋样
1，不管你的样本结果怎么样，只要阴性有峰，这个实验就不可信，要全盘否定
2，再做实验，确实是你的引物问题了 就换引物，否则不能排除是污染了模板
3，标准曲线，至少也要5个点，3重复，CT值太小了影响判断