【求助/交流】pcr问题求助
请问谁p过真菌的ITS?
小半年了，一直p都没p出来，ITS应该是很保守的序列，我p的是尖孢镰刀菌的。
我用的引物是：
ITS4：TCC TCC gCT TAT TgA TAT gC Tm：55.75
ITS5：ggA Agg TAA AAg TCA Agg Tm：52.74
我的体系是：20
双蒸水：12
10*buffer：2
镁离子：1.5
dNTP：1
P1：1
P2：1
模版：1
Taq酶：0.5
程序：94度5min，94度30s，44度45s，72度1min(30 cycle) 72度10min 4度保存。
请指教，不胜感激
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京公网安备 11010802022153号
这么低的退火温度还P不出来，会不会是模板的原因？引物酶问题吧？
实验室师兄用相同的体系，药品，引物，程序p出来过，模版DNA条带很亮。
20ul 体系一般模板 酶 引物都加0.4微升啊~我是这样的体系!退火温度低，一般都在50以上！
72度延伸1min是不是有点短啊
不懂，顶下～～～
你dNTP浓度是多大的？如果是10mM的，你就加的有点多了。
退火温度太低了，我做的时候用的50度，楼主各成分的添加量都有点大，模板的浓度很重要，如果模板浓度大的话，那你添加这些就太多了，