酿酒酵母同源重组问题求助
本人是一名研一学生，从11月份接触酵母同源重组已经快4个月了，可一直失败。
我所用的菌种为BY4741，同源臂长度为60bp，用的loxp/cre系统。抗性筛选用的G418，浓度为400mg/L。每次筛选得到的都是假阳性的菌种，可我的阴性对照板上一个也不长（阴性对照我采用的是转入一段大小相似的没有抗性的基因），这证明我的敲除组件还是转进去了，使得菌种携带有抗性，可为什么验证不出来呢？难道存在敲除组件转进去但没有重组成功这种可能吗？抗性板上长出来的菌都特别小，不是正常的状态。跪求高手指点迷津。
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京公网安备 11010802022153号
同源臂有些短建议提高到200-400bp,会比较容易了。
g418就是容易假阳性，换潮霉素抗性质粒就好了
酿酒酵母一般所用同源臂为30-60bp，我参考的文献用的是60bp做出来了，只是他们用的是SCY876这个型号的酿酒酵母菌。想问一下您
1、同属于酿酒酵母菌，因为遗传背景的不同，所需的同源臂长度也不一样吗？
2、您说的同源臂提高到200-400bp是用的两步法敲除吗？我现在用的一步法敲除，在设计敲除组件引物是60bp同源臂+20bploxp上下游，引物的费用已经高达400元了，求大神解惑
，
涂布太密也会导致菌落长不大，你都验证了菌落都是假阳性？没有目的基因？
你整合的片段是多长的？你现在实验成功了吗？
我现在利用CRISPR很容易将外源基因整合到酵母， 不知道是不是多此一举，收到信息请回复，希望和你讨论一下， 我的QQ2817518626