请问这里有没有朋友测过植物根部的NADPH的活性啊,,,有的话还望请教一下啊。。。谢谢了。。 返回小木虫查看更多
以前实验室有师兄做过NADH含量的测定,不知道你这是不是一样,估计原理应该是一样的。 根据NADH特异的A340的吸收峰,制作标准曲线,然后据此测定样品中的含量。 如果想测定相关酶的活性,就在反应系统中定量加入改酶反应,根据NADH的变化量来确定酶活。 希望能够有帮助。
NADPH/NADH的测定需要购买试剂盒。你可以自己google
NADPH怎么能是活性呢,你是做G6PDH,还是6PGDH?
已经测过一次NADPH氧化酶的活性,但是数值没有变化,不知道是哪里出现了问题。实验的时候没有找到具体的操作步骤,只是找了N 篇文献综合总结了一下,想的实践出真知,就大胆的做了,结果失败了。哪位仁兄测过,指点一二。 我参照的实验方法: 由NADPH氧化酶生成的活性氧产物被检测到,在25度下,SOD抑制的,NADPH依赖的在550nm下细胞色素C的减少。像Heyworth et al (1993)描述那样,反应混合液包括0.1mM的细胞色素C,6.5mMMgCL,87Mmkcl,2.6mMNaCL,8.7mMPipes,Ph 7.3,10pM GTP(y)S,0.16Mmnadph,he10-15pg质膜蛋白,总体积1ml。对照试验包括50pg的SOD来说明在没有活性氧依赖的细胞色素的减少。DPI(at 5 pM),质膜NADPH氧化酶的一种酶激活不可逆抑制剂,抑制激发子激发的NADPH氧化酶的活性。 我遇到的问题: 膜蛋白是高速离心后提取的,应该没有什么问题。测定时加的是150微克。 我遇到的问题是:1,加入SOD和不加sod的对照和处理,及重复之间的吸光值都在0.200-0.215之间,数值之间没有差异。 2,虽然现在实验还没有做出来,但是希望您能把计算的公式也给我一份。 因为我没有找到详细的实验步骤。实验准备的时候我综合了好几个实验版本。下面是我的操作步骤,以便你帮助我找到我错误的地方:1 先加膜蛋白 2 (将所用的试剂配成混合液,有两份,一份加了SOD,一份没有)加入反应混合液。 3 加入NADPH启动反应,5min后测定其吸光值。 我一个处理做了6管,3管加的是有SOD的混合液,另外3管加的是没有SOD的混合液。 其实我也试过加入NADPH后立即测其5min的吸光值,但是在5min的反应过程中,吸光值根本没有变化。加入浓度的NADPH时吸光值有微小的变化。 我也想知道怎么做,求助,交流,
以前实验室有师兄做过NADH含量的测定,不知道你这是不是一样,估计原理应该是一样的。
根据NADH特异的A340的吸收峰,制作标准曲线,然后据此测定样品中的含量。
如果想测定相关酶的活性,就在反应系统中定量加入改酶反应,根据NADH的变化量来确定酶活。
希望能够有帮助。
NADPH/NADH的测定需要购买试剂盒。你可以自己google
NADPH怎么能是活性呢,你是做G6PDH,还是6PGDH?
已经测过一次NADPH氧化酶的活性,但是数值没有变化,不知道是哪里出现了问题。实验的时候没有找到具体的操作步骤,只是找了N 篇文献综合总结了一下,想的实践出真知,就大胆的做了,结果失败了。哪位仁兄测过,指点一二。 我参照的实验方法:
由NADPH氧化酶生成的活性氧产物被检测到,在25度下,SOD抑制的,NADPH依赖的在550nm下细胞色素C的减少。像Heyworth et al (1993)描述那样,反应混合液包括0.1mM的细胞色素C,6.5mMMgCL,87Mmkcl,2.6mMNaCL,8.7mMPipes,Ph 7.3,10pM GTP(y)S,0.16Mmnadph,he10-15pg质膜蛋白,总体积1ml。对照试验包括50pg的SOD来说明在没有活性氧依赖的细胞色素的减少。DPI(at 5 pM),质膜NADPH氧化酶的一种酶激活不可逆抑制剂,抑制激发子激发的NADPH氧化酶的活性。
我遇到的问题:
膜蛋白是高速离心后提取的,应该没有什么问题。测定时加的是150微克。
我遇到的问题是:1,加入SOD和不加sod的对照和处理,及重复之间的吸光值都在0.200-0.215之间,数值之间没有差异。
2,虽然现在实验还没有做出来,但是希望您能把计算的公式也给我一份。
因为我没有找到详细的实验步骤。实验准备的时候我综合了好几个实验版本。下面是我的操作步骤,以便你帮助我找到我错误的地方:1 先加膜蛋白
2 (将所用的试剂配成混合液,有两份,一份加了SOD,一份没有)加入反应混合液。
3 加入NADPH启动反应,5min后测定其吸光值。
我一个处理做了6管,3管加的是有SOD的混合液,另外3管加的是没有SOD的混合液。
其实我也试过加入NADPH后立即测其5min的吸光值,但是在5min的反应过程中,吸光值根本没有变化。加入浓度的NADPH时吸光值有微小的变化。
我也想知道怎么做,求助,交流,