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急求：土壤硝态氮和氨态氮的测定方法

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可以参考《土壤农化分析〉一书
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1、酚二磺酸比色法
1）方法原理
土壤用饱和CaSO4 2H2O溶液浸提，在微碱性条件下蒸发至干，土壤浸提液中的NO3－—N在无水的条件下能与酚二磺酸试剂作用，生成硝基酚二磺酸。
C6H3OH(HSO3)2+HNO3→C6H2OH(HSO3)2 NO2+H2O
2，4-酚二磺酸       6-硝基酚-2，4-二磺酸
此反应必须在无水条件下才能迅速完成，反应产物在酸性介质中无色，碱化后则为稳定的黄色溶液，黄色的深浅与NO3－—N含量在一定范围内成正相关，可在400～425nm处（或用蓝色滤光片）比色测定。酚二磺酸法的灵敏度很高，可测出溶液中0.1mg•L-1 NO3－—N，测定范围为0.1～2mg•L-1。
2）主要仪器
分光光度计、水浴锅、瓷蒸发皿。
3）试剂
（1）酚二磺酸试剂：
称取白色苯酚（C6H5OH，分析纯）25.0g置于500mL三角瓶中，以150mL纯浓H2SO4溶解，再加入发烟H2SO475mL并置于沸水中加热2h，可得酚二磺酸溶液，储于棕色瓶中保存。使用时须注意其强烈的腐蚀性。如无发烟H2SO4，可用酚25.0g，加浓H2SO4225mL，沸水加热6h配成。试剂冷后可能析出结晶，用时须重新加热溶解，但不可加水，试剂必须贮于密闭的玻塞棕色瓶中，严防吸湿。
（2）10µg•mL-1 NO3－—N标准溶液：
准确称取KNO3（二级）0.7221g溶于水，定容1L，此为100µg•mL-1 NO3－—N溶液，将此液准确稀释10倍，即为10µg•mL-1 NO3－—N标准溶液。
（3）CaSO4•2H2O（分析纯、粉状）、
（4）CaCO3（分析纯、粉状）、
（5）1:1 NH4OH、
（6）活性碳（不含NO3－），用以除去有机质的颜色。
（7）Ag2SO4（分析纯、粉状）、Ca(OH)2（分析纯、粉状）和MgCO3（分析纯、粉状），用以消除Cl-1的干扰。
4）操作步骤
（1）浸提：
称取新鲜土样（注1）50g（风干土样25g）放在500mL三角瓶中，加入CaSO4•2H2O 0.5g（注2）[凝聚剂的作用，使滤液不混浊而澄清]和250.00mL蒸馏水，盖塞后，用振荡机振荡10min。放置5 min后，将悬液的上部清液用干滤纸过滤，澄清的滤液收集地干燥洁净的三角瓶中。如果滤液因有机质而呈现颜色，可加活性碳除之（注3、4）。还有NO2-干扰和Cl干扰：
（1）同时做空白。
（2）测定
吸取清液 25～50mL（含NO3－—N 20～150µg）于瓷蒸发皿中，加CaCO3约0.05g（注5）[调节pH，防止NO3－—N在酸性和中性条件下蒸干分解而损失]，在水浴上蒸干（注6），到达干燥时不应继续加热。稍冷，迅速加入酚二磺酸试剂1---2 mL，将皿旋转，使试剂接触到所有的蒸干物。静止10min使其充分作用后，加水20 mL，用玻璃棒搅拌直到蒸干物完全溶解。冷却后缓缓加入1：1 NH4OH（注7）并不断搅拌混匀，至溶液呈微碱性（溶液显黄色  不再加深）再多加2mL，以保证NH4OH试剂过量。然后将溶液全部转入100mL容量瓶中，加水定容（注8）。在分光光度计上用光径1cm比色杯在波长420nm处比色，以空白溶液作参比，调节仪器零点。
（2）同时，NO3－—N工作曲线绘制：分别取10µg•mL-1NO3－—N标准液0、1、2、5、10、15、20mL于蒸发皿中，在水浴上蒸干，与待测液相同操作，进行显色和比色，绘制成标准曲线，或用计算器求出回归方程。
5）结果计算
土壤中NO3－—N含量（mg•kg-1）
=
式中：C(NO3－-N)——从标准曲线上查得（或回归所求）的显色液NO3－-N 质量浓度（µg•mL-1）；
            V——显色液的体积（mL）；
            ts——分取倍数；
            m——风干样品质量，g。
            H——风干样品水分质量含量百分数。
6）注释
注1．
硝酸根为阴离子，不为土壤胶体吸附，且易溶于水，很易在土壤内部移动，在土壤剖面上下层移动频繁，因此测定硝态氮时注采样深度。即不仅要采集表层土壤，而且要采集心土和底土，采样深度可达40cm、60 cm以至120 cm。试验证明，旱地土壤上分析全剖面的硝态氮含量能更好地反映土壤的供氮水平。和表层土壤比较，则全剖面的硝态氮含量与生物反应之间有更好的相关性，土壤经风干或烘干易引起NO3－—N变化，故一般都用新鲜土样测定。

注2．
用酚二磺酸法测定硝态氮，首先要求浸提液清彻，不能混浊，但是一般中性或碱性土壤滤液不易澄清，且带有机质的颜色，为此在浸提液中应加入凝聚剂。凝聚剂的种类很多，有CaSO4、CaO、Ca(OH)2、CaCO3、MgCO3、KAl(SO4)2、CuSO4等，其中CuSO4有防止生物转化的作用，但在过滤前必须以氢氧化钙或碳酸镁除去多余的铜，因此以CaSO4法提取较为方便。

注3．
如果土壤浸提液由于有机质而有较深的颜色，则可用活性炭除去，但不宜用H2O2，以防最后显色时反常。

注4．
土壤中的亚硝酸根和氯离子是本法的主要干扰离子。亚硝酸和酚二磺酸产生同样的黄色化合物，但一般土壤中亚硝酸含量极少，可忽略不计。必要时可加少量尿素、硫尿和氨基磺酸（20g•L-1NH2SO3H）以除去之。例如亚硝酸根如果超出了1µg•mL-1时，一般每10mL待测液中加入20mg尿素，并放置过夜，以破坏亚硝酸根。
检查亚硝酸根的方法：可取待测液5滴于白瓷板上，加入亚硝酸试粉0.1g，用玻璃棒搅拌后，放置10min，如有红色出现，即有1mg•L-1亚硝酸根存在。如果红色极浅或无色，则可省去破坏亚硝酸根手续。
Cl-对反应的干扰，主要是加酸后生成亚硝酰氯化合物或其它氯的气体。如果土壤中含氯化合物超过15mg•kg-1，则必须加Ag2SO4除去，方法是每100mL浸出液中加入 Ag2SO4 0.1g (0.1g Ag2SO4 可沉淀22.72mg Cl-)，摇动15min，然后加入Ca(OH)2 0.2g及MgCO3 0.5g，以沉过量的银，摇动5min后过滤，继续按蒸干显色步骤进行。
NO3- + 3Cl- + 4H+ → NOCl + Cl2 + 2H2O
亚硝酰氯
注5．
在蒸干过程中加入碳酸钙是为了防止硝态氮的损失。因为在酸性和中性条件下蒸干易导致硝酸离子的分解，如果浸出液中含铵盐较多，更易产生负误差。

注6．
此反应必须在无水条件下才能完成，因此反应前必须蒸干。

注7．
碱化时应用NH4OH，而不用NaOH或KOH，是因为NH3能与Ag+络合成水溶性的[ (NH3)2]+，不致生成Ag2O的黑色沉淀而影响比色。

注8．
在蒸干前，显色和转入容量瓶时应防止损失，
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铵态氮测定：
2、 2mol•L-1KCl浸提—靛酚蓝比色法
1）方法原理
  2mol•L-1KCl溶液浸提土壤，把吸附在土壤胶体上的NH4+及水溶性NH4+浸提出来。土壤浸提液中的铵态氮在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝，溶液的颜色很稳定。在含氮0.05～0.5mol•L-1的范围内，吸光度与铵态氮含量成正比，可用比色法测定。
2）试剂
（1）2mol•L-1KCl溶液  称取149.1g氯化钾（KCl，化学纯）溶于水中，稀释至1L。
（2）苯酚溶液  称取苯酚（C6H5OH，化学纯）10g和硝基铁氰化钠[Na2Fe(CN)5NO2H2O]100mg稀释至1L。此试剂不稳定，须贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。
（3）次氯酸钠碱性溶液  称取氢氧化钠（化学纯）10g、磷酸氢二钠（Na2HPO4•7H2O, 化学纯）7.06g、磷酸钠（Na3PO4•12H2O, 化学纯）31.8g和 52.5g•L-1次氯酸钠(NaOCl，化学纯，即含5%有效氯的漂白粉溶液)10mL溶于水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。
（4）掩蔽剂  将400g•L-1的酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O, 化学纯）与100g•L-1的EDTA二钠盐溶液等体积混合。每100mL混合液中加入10 mol•L-1氢氧化钠0.5mL。
（5）2.5µg•mL –1铵态氮（NH4+—N）标准溶液  称取干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4，分析纯]0.4717g溶于水中，洗入容量瓶后定容至1L，制备成含铵态氮（N）100µg•mL –1的贮存溶液；使用前将其加水稀释40倍，即配制成含铵态氮（N）2.5µg•mL –1的标准溶液备用。
3）仪器与设备
往复式振荡机、分光光度计。
4）分析步骤
（1）浸提  称取相当于20.00g干土的新鲜土样（若是风干土，过10号筛）准确到0.01g，置于200mL三角瓶中，加入氯化钾溶液100mL，塞紧塞子，在振荡机上振荡1h。取出静置，待土壤—氯化钾悬浊液澄清后，吸取一定量上层清液进行分析。如果不能在24h内进行，用滤纸过滤悬浊液，将滤液储存在冰箱中备用。
（2）比色  吸取土壤浸出液2mL～10mL(含NH4+—N2µg～25µg)放入50mL容量瓶中，用氯化钾溶液补充至10mL，然后加入苯酚溶液5mL和次氯酸钠碱性溶液5mL，摇匀。在20℃左右的室温下放置1h后（注1），加掩蔽剂1mL以溶解可能产生的沉淀物，然后用水定容至刻度。用1cm比色槽在625nm波长处（或红色滤光片）进行比色，读取吸光度。
（3）工作曲线分别吸取0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00mL
NH4+—N标准液于50mL容量瓶中，各加10mL氯化钠溶液，同（2）步骤进行比色测定。
5）结果计算
土壤中NH4+—（N）含量（mg•kg-1）=
式中：ρ——显色液铵态氮的质量浓度(µg•mL –1)；
   V——显色液的体积(mL)；m
   ts——分取倍数；
   m——样品质量（g）。
6）注释
注1. 显色后在20℃左右放置1h,再加入掩蔽剂.过早加入会使显色反应很慢,蓝色偏弱;加入过晚,则生成的氢氧化物沉淀可能老化而不易溶解.

参考文献
（1）南京农业大学主编. 土壤农化分析（二版）北京:农业出版社, 1986, 40～64
（2）李酉开. 紫外分光光度法测定硝酸盐, 土壤学进展. 1992, 6, 44～45
（3）易小琳, 李酉开, 韩琅丰. 紫外分光光度法测定硝酸氮. 土壤通报. 1983, 6
（4）鲍士旦主编. 土壤农化分析（三版）北京:中国农业出版社, 2000, 49～61
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