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zoe回望

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 真菌PCR没有条带,求大神相助! 已有2人参与

我才开始做DNA提取,提的是霉菌一类的,总DNA有条带,看得见,但是PCR之后没有条带。
引物用的是its1和its4(老师在上海生工买的,its1的Tm值是61.9摄氏度,its4的Tm值是55.8摄氏度),用的是mix,一共50ul,模板2ul,mix25ul,引物各1ul,用灭菌超纯水不足50ul。
程序1是:93度,3min;
              94度,1min;52度,1min;72度,1.5min(35个循环)
              72度,10min。
程序2是:45度,10min;
              94度,1min;57度,45s;72度,1min(35个循环)
              72度,10min。
这个两个程序我都没有任何条带,求有经验的大神指导!万分感谢!!

真菌PCR没有条带,求大神相助!
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zoe回望

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by yishi0707 at 2016-10-22 12:58:33
请问一下梯度PCR怎么做呢?我也遇到在这种情况,还有就是退火温度比Tm值低5度左右是怎么衡量的?新手求指教,谢谢...

梯度是pcr仪上的,你设置温度,比如52.60中间就会有很多温度,把管子放在对应的位置就是所需温度。

发自小木虫Android客户端
6楼2016-10-22 16:46:54
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
一般退火温度要比Tm值低5度左右,因此程序2是不合理的,程序1比较合理。
我循环中94度和52度一般都只设置30s,不宜太长,变性时间太长酶也是会失活的。
您是否有用过降落伞PCR或者梯度PCR?建议使用降落伞PCR,退火温度从65度开始降至50度。看看能不能解决问题~
2楼2016-01-20 16:56:51
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zoe回望

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-20 16:56:51
一般退火温度要比Tm值低5度左右,因此程序2是不合理的,程序1比较合理。
我循环中94度和52度一般都只设置30s,不宜太长,变性时间太长酶也是会失活的。
您是否有用过降落伞PCR或者梯度PCR?建议使用降落伞PCR,退 ...

您说的两个降落,我都没有用过的,请问是0.5度这样降吗?非常感谢,请问,引物对吗?在总DNA的时候确实是看的见条带的,非常感谢.

发自小木虫Android客户端
3楼2016-01-21 16:44:39
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逆流的鱼11

木虫 (著名写手)

4楼2016-01-21 17:01:13
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