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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 真菌PCR没有条带，求大神相助！
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zoe回望

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 真菌PCR没有条带，求大神相助！ 已有2人参与

我才开始做DNA提取，提的是霉菌一类的，总DNA有条带，看得见，但是PCR之后没有条带。
引物用的是its1和its4（老师在上海生工买的，its1的Tm值是61.9摄氏度，its4的Tm值是55.8摄氏度），用的是mix，一共50ul，模板2ul，mix25ul，引物各1ul，用灭菌超纯水不足50ul。
程序1是：93度，3min；
              94度，1min；52度,1min;72度，1.5min（35个循环）
              72度，10min。
程序2是：45度，10min；
              94度，1min；57度,45s;72度，1min（35个循环）
              72度，10min。
这个两个程序我都没有任何条带，求有经验的大神指导！万分感谢！！

真菌PCR没有条带，求大神相助！
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1楼 2016-01-19 16:50:49
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lifechuteng

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般退火温度要比Tm值低5度左右，因此程序2是不合理的，程序1比较合理。
我循环中94度和52度一般都只设置30s，不宜太长，变性时间太长酶也是会失活的。
您是否有用过降落伞PCR或者梯度PCR？建议使用降落伞PCR，退火温度从65度开始降至50度。看看能不能解决问题~
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2楼2016-01-20 16:56:51
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zoe回望

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lifechuteng at 2016-01-20 16:56:51
一般退火温度要比Tm值低5度左右，因此程序2是不合理的，程序1比较合理。
我循环中94度和52度一般都只设置30s，不宜太长，变性时间太长酶也是会失活的。
您是否有用过降落伞PCR或者梯度PCR？建议使用降落伞PCR，退 ...

您说的两个降落，我都没有用过的，请问是0.5度这样降吗？非常感谢，请问，引物对吗？在总DNA的时候确实是看的见条带的，非常感谢.

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3楼2016-01-21 16:44:39
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逆流的鱼11

木虫 (著名写手)
不懂啊

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4楼2016-01-21 17:01:13
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yishi0707

禁虫 (初入文坛)
本帖内容被屏蔽
5楼2016-10-22 12:58:33
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zoe回望

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yishi0707 at 2016-10-22 12:58:33
请问一下梯度PCR怎么做呢?我也遇到在这种情况，还有就是退火温度比Tm值低5度左右是怎么衡量的？新手求指教，谢谢...

梯度是pcr仪上的，你设置温度，比如52.60中间就会有很多温度，把管子放在对应的位置就是所需温度。

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6楼2016-10-22 16:46:54
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夜一

新虫 (小有名气)
退火温度53度，30秒

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7楼2016-12-02 20:11:49
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一个不小心就

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

模板或引物浓度高了也可能p不出来。。。。看你的引物浓度不高，所以可以试试把模版稀释一下
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8楼2016-12-02 23:43:12
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yang6101

新虫 (初入文坛)
遇到同样的问题，楼主最后怎么解决的？

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9楼2021-04-08 01:26:36
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