应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 【求助】菌液Pcr 阳性率很低，载体双酶切后不彻底？
21/1返回列表
查看: 1570  |  回复: 4
查看全部回帖 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

Doge Ku

新虫 (初入文坛)

[求助] 【求助】菌液Pcr 阳性率很低，载体双酶切后不彻底？ 已有2人参与

研一小菜鸟一枚。上个月带我的老师让我构建7个载体。现在已经构建出6个，剩下一个做了几次都没做出来。目的片段大小1.3Kb，载体为5Kb。用的是neb的EcorI和EcorV双酶切，两个酶切位点之间间隔大约750Kb。目的片段用的是neb BsmBI和EcorV酶切。载体酶切体系试过20微升和50微升，载体量分辨是1微克和2微克。目的片段全部酶切，用的是50微升体系。跑胶回收时，能看一条5Kb和一条750bp的条带。连接用的是neb的T4,10微升体系，16度过夜。目的片段的浓度是20纳克每微升，载体也是。两者摩尔比为1:8。 结合前面6次阳性率很低的经验，我在连接时做了一个对照，用已经回收的双酶切的载体不加目的片段连接，之后做转化。发现对照组长满了菌。酶切这个步骤已经重复两次了，但依然如此。我试着调了16个菌落做菌液pcr，但全部为阴性。请问各位大牛怎么看？
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-12-21 21:49:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fengjunchen

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先，EcorI切出来是粘性末端，BsmBI切出来是平末端，不是同尾酶本来就连不上；虽然另一端都是EcorV，但连接效率依然会很低，或者说会比自连的概率都低很多。双酶切，还是老老实实用同样的酶或同尾酶吧。
其次，应该是插入片段多，载体少，我自己做时是 插入：载体=10:1
赞一下 回复此楼
5楼2016-04-29 16:48:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Doge Ku 的主题更新
21/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭