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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 【求助】菌液Pcr 阳性率很低，载体双酶切后不彻底？
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Doge Ku

新虫 (初入文坛)

[求助] 【求助】菌液Pcr 阳性率很低，载体双酶切后不彻底？ 已有2人参与

研一小菜鸟一枚。上个月带我的老师让我构建7个载体。现在已经构建出6个，剩下一个做了几次都没做出来。目的片段大小1.3Kb，载体为5Kb。用的是neb的EcorI和EcorV双酶切，两个酶切位点之间间隔大约750Kb。目的片段用的是neb BsmBI和EcorV酶切。载体酶切体系试过20微升和50微升，载体量分辨是1微克和2微克。目的片段全部酶切，用的是50微升体系。跑胶回收时，能看一条5Kb和一条750bp的条带。连接用的是neb的T4,10微升体系，16度过夜。目的片段的浓度是20纳克每微升，载体也是。两者摩尔比为1:8。 结合前面6次阳性率很低的经验，我在连接时做了一个对照，用已经回收的双酶切的载体不加目的片段连接，之后做转化。发现对照组长满了菌。酶切这个步骤已经重复两次了，但依然如此。我试着调了16个菌落做菌液pcr，但全部为阴性。请问各位大牛怎么看？
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1楼 2015-12-21 21:49:31
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fengjunchen

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先，EcorI切出来是粘性末端，BsmBI切出来是平末端，不是同尾酶本来就连不上；虽然另一端都是EcorV，但连接效率依然会很低，或者说会比自连的概率都低很多。双酶切，还是老老实实用同样的酶或同尾酶吧。
其次，应该是插入片段多，载体少，我自己做时是 插入：载体=10:1
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5楼2016-04-29 16:48:52
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kingjazz23

金虫 (小有名气)
你好 可不可以先告诉我构建的完整过程 我也是做这方面的 现在做到了摇菌 之前做了个菌落PCR 摇完菌打算提质粒测序做酶切 想问问后面的步骤是什么 就是我做完酶切后还要做什么步骤

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2楼2016-04-13 15:54:58
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showhand

新虫 (初入文坛)
是不是培养基抗性失效了啊，不然怎么对照都长很多菌落

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3楼2016-04-28 09:18:06
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bigbang飒

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

载体比片段弄反了吧，应该是片段比较多

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4楼2016-04-29 09:35:42
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