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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 转化子菌落PCR正确，但是菌液提取重组质粒一直提不到是什么原因？
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

[求助] 转化子菌落PCR正确，但是菌液提取重组质粒一直提不到是什么原因？ 已有6人参与

最近做质粒重组，转化子菌落PCR正确，有目的条带，但是条带不是很亮的那种，然后挑取转化子菌液培养，抗生素的浓度足够高，提取质粒，总是在第三步十分钟离心之后，上清液都有些浑浊，离心力足够大，时间足够长继续提取检测，都没有提取到质粒。试剂盒没有问题，因为同批转化的载体质粒能提取出来。
       急求各位有遇到类似问题的给出宝贵的意见，不胜感激。
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1楼 2015-09-03 11:52:51
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
“转化子菌落PCR正确，有目的条带，但是条带不是很亮的那种”－－－－基本都是假阳性，不用继续往下做了。

做菌落PCR，最好是用载体上的引物，或者一条载体上的一条基因特异引物搭配
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2015-09-04 05:06:59
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-04 22:58:26
因为你用的是目的基因的PCR引物，所以菌落PCR都是假阳性。如果你想菌落PCR鉴定的话，就用载体上的引物，别用你目的基因的引物。
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3楼2015-09-03 15:54:37
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chenyuanxmc

金虫 (著名写手)
没遇到过这种情况，会不会是杂菌啊

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2楼2015-09-03 13:21:52
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上
引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2015-09-04 05:06:59
“转化子菌落PCR正确，有目的条带，但是条带不是很亮的那种”－－－－基本都是假阳性，不用继续往下做了。

做菌落PCR，最好是用载体上的引物，或者一条载体上的一条基因特异引物搭配

哦，好吧，那就是转化失败了？
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
5楼2015-09-04 15:35:02
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普通回帖

zeroon

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
三楼四楼说的是对的，但也不一定。用目的基因的引物PCR，假阳性的条带比阳性条带要淡，这点还是能区分出来的。牙签点菌的时候别戳到培养基上，只在菌落表明粘一下就好。

另外，你提取质粒的方法操作有问题，中和后离心，上清液不会浑浊，即使菌体量没裂解完全大也不会。你好好对照分子克隆手册或者试剂盒说明书看，自己究竟哪一步有问题。这种问题都不用师兄师姐演示的，因为太简单了，说白了就是你操作问题。
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6楼2015-09-05 17:21:39
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上
引用回帖:
6楼: Originally posted by zeroon at 2015-09-05 17:21:39
三楼四楼说的是对的，但也不一定。用目的基因的引物PCR，假阳性的条带比阳性条带要淡，这点还是能区分出来的。牙签点菌的时候别戳到培养基上，只在菌落表明粘一下就好。

另外，你提取质粒的方法操作有问题，中和 ...

之前提取质粒一直都没有问题，就这次出现这样的情况，重复了一次，还这样，不知是不是菌液中没有质粒造成的？
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喜欢生物，所以想好好研究下去！
7楼2015-09-06 07:52:46
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冰霜之灵

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
质粒没有转到细胞里面去
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8楼2015-09-06 10:24:24
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yc113078

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以肯定是你转化失败了，可以考虑下抗生素是否失效。
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9楼2015-09-06 11:22:36
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x960495082

木虫 (正式写手)
建议用测序引物做PCR。

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10楼2015-09-06 12:18:31
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