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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

[求助] 转化子菌落PCR正确,但是菌液提取重组质粒一直提不到是什么原因? 已有6人参与

最近做质粒重组,转化子菌落PCR正确,有目的条带,但是条带不是很亮的那种,然后挑取转化子菌液培养,抗生素的浓度足够高,提取质粒,总是在第三步十分钟离心之后,上清液都有些浑浊,离心力足够大,时间足够长继续提取检测,都没有提取到质粒。试剂盒没有问题,因为同批转化的载体质粒能提取出来。
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4楼: Originally posted by gyesang at 2015-09-04 05:06:59
“转化子菌落PCR正确,有目的条带,但是条带不是很亮的那种”----基本都是假阳性,不用继续往下做了。

做菌落PCR,最好是用载体上的引物,或者一条载体上的一条基因特异引物搭配

哦,好吧,那就是转化失败了?
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5楼2015-09-04 15:35:02
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6楼: Originally posted by zeroon at 2015-09-05 17:21:39
三楼四楼说的是对的,但也不一定。用目的基因的引物PCR,假阳性的条带比阳性条带要淡,这点还是能区分出来的。牙签点菌的时候别戳到培养基上,只在菌落表明粘一下就好。

另外,你提取质粒的方法操作有问题,中和 ...

之前提取质粒一直都没有问题,就这次出现这样的情况,重复了一次,还这样,不知是不是菌液中没有质粒造成的?
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7楼2015-09-06 07:52:46
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9楼: Originally posted by yc113078 at 2015-09-06 11:22:36
可以肯定是你转化失败了,可以考虑下抗生素是否失效。

到底是转化失败,还是连接失败呢?因为阳性对照的空白质粒转进去有转化子,培养提质粒也是对的呢
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11楼2015-09-07 08:08:53
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10楼: Originally posted by x960495082 at 2015-09-06 12:18:31
建议用测序引物做PCR。

哦,谢谢,这样的话,是因为转化失败,还是连接失败呢?
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12楼2015-09-07 08:09:25
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引用回帖:
14楼: Originally posted by jonew at 2015-09-08 07:31:35
不是,重新挑斑再做,很正常,假阳性,
...

就是还是存在有效的菌落的,是吧?因为我也在想这个问题,既然有转化子,不就代表连接和转化成功了吗?因为平板都是加了抗性的,宿主菌又没有抗性,只有质粒载体上有抗性啊
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15楼2015-09-08 08:12:00
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13楼: Originally posted by gyesang at 2015-09-08 03:09:27
不是转化失败,是你的连接失败...

如果连接失败的话,为啥会在有抗性的平板上有单菌落呢?感受态没有抗性,只有质粒载体有抗性呢?
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16楼2015-09-08 08:12:44
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