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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

[求助] 转化子菌落PCR正确,但是菌液提取重组质粒一直提不到是什么原因? 已有6人参与

最近做质粒重组,转化子菌落PCR正确,有目的条带,但是条带不是很亮的那种,然后挑取转化子菌液培养,抗生素的浓度足够高,提取质粒,总是在第三步十分钟离心之后,上清液都有些浑浊,离心力足够大,时间足够长继续提取检测,都没有提取到质粒。试剂盒没有问题,因为同批转化的载体质粒能提取出来。
       急求各位有遇到类似问题的给出宝贵的意见,不胜感激。
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gyesang

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【答案】应助回帖

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“转化子菌落PCR正确,有目的条带,但是条带不是很亮的那种”----基本都是假阳性,不用继续往下做了。

做菌落PCR,最好是用载体上的引物,或者一条载体上的一条基因特异引物搭配
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2015-09-04 05:06:59
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-04 22:58:26
因为你用的是目的基因的PCR引物,所以菌落PCR都是假阳性。如果你想菌落PCR鉴定的话,就用载体上的引物,别用你目的基因的引物。
3楼2015-09-03 15:54:37
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chenyuanxmc

金虫 (著名写手)

没遇到过这种情况,会不会是杂菌啊

发自小木虫Android客户端
2楼2015-09-03 13:21:52
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

引用回帖:
4楼: Originally posted by gyesang at 2015-09-04 05:06:59
“转化子菌落PCR正确,有目的条带,但是条带不是很亮的那种”----基本都是假阳性,不用继续往下做了。

做菌落PCR,最好是用载体上的引物,或者一条载体上的一条基因特异引物搭配

哦,好吧,那就是转化失败了?
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5楼2015-09-04 15:35:02
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普通回帖

zeroon

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
三楼四楼说的是对的,但也不一定。用目的基因的引物PCR,假阳性的条带比阳性条带要淡,这点还是能区分出来的。牙签点菌的时候别戳到培养基上,只在菌落表明粘一下就好。

另外,你提取质粒的方法操作有问题,中和后离心,上清液不会浑浊,即使菌体量没裂解完全大也不会。你好好对照分子克隆手册或者试剂盒说明书看,自己究竟哪一步有问题。这种问题都不用师兄师姐演示的,因为太简单了,说白了就是你操作问题。
6楼2015-09-05 17:21:39
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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

引用回帖:
6楼: Originally posted by zeroon at 2015-09-05 17:21:39
三楼四楼说的是对的,但也不一定。用目的基因的引物PCR,假阳性的条带比阳性条带要淡,这点还是能区分出来的。牙签点菌的时候别戳到培养基上,只在菌落表明粘一下就好。

另外,你提取质粒的方法操作有问题,中和 ...

之前提取质粒一直都没有问题,就这次出现这样的情况,重复了一次,还这样,不知是不是菌液中没有质粒造成的?
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7楼2015-09-06 07:52:46
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冰霜之灵

铁虫 (初入文坛)

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质粒没有转到细胞里面去
8楼2015-09-06 10:24:24
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yc113078

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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可以肯定是你转化失败了,可以考虑下抗生素是否失效。
9楼2015-09-06 11:22:36
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x960495082

木虫 (正式写手)

10楼2015-09-06 12:18:31
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