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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

[求助] 转化子菌落PCR正确,但是菌液提取重组质粒一直提不到是什么原因? 已有6人参与

最近做质粒重组,转化子菌落PCR正确,有目的条带,但是条带不是很亮的那种,然后挑取转化子菌液培养,抗生素的浓度足够高,提取质粒,总是在第三步十分钟离心之后,上清液都有些浑浊,离心力足够大,时间足够长继续提取检测,都没有提取到质粒。试剂盒没有问题,因为同批转化的载体质粒能提取出来。
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喜欢生物,所以想好好研究下去!
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gyesang

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
“转化子菌落PCR正确,有目的条带,但是条带不是很亮的那种”----基本都是假阳性,不用继续往下做了。

做菌落PCR,最好是用载体上的引物,或者一条载体上的一条基因特异引物搭配
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2015-09-04 05:06:59
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gyesang

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引用回帖:
5楼: Originally posted by wu-ke-da at 2015-09-04 15:35:02
哦,好吧,那就是转化失败了?...

不是转化失败,是你的连接失败
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
13楼2015-09-08 03:09:27
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gyesang

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引用回帖:
16楼: Originally posted by wu-ke-da at 2015-09-08 08:12:44
如果连接失败的话,为啥会在有抗性的平板上有单菌落呢?感受态没有抗性,只有质粒载体有抗性呢?...

那是载体自连或者载体没有酶切完全的结果
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
18楼2015-09-10 11:56:40
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gyesang

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引用回帖:
15楼: Originally posted by wu-ke-da at 2015-09-08 08:12:00
就是还是存在有效的菌落的,是吧?因为我也在想这个问题,既然有转化子,不就代表连接和转化成功了吗?因为平板都是加了抗性的,宿主菌又没有抗性,只有质粒载体上有抗性啊...

你有什么证据表明你载体被酶切开了?拿酶切后的载体,同样加酶连接,看看是否还能长出菌落?如果有菌落长出就说明载体没有被完全酶切开
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
19楼2015-09-10 11:58:35
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