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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

[求助] 转化子菌落PCR正确,但是菌液提取重组质粒一直提不到是什么原因? 已有6人参与

最近做质粒重组,转化子菌落PCR正确,有目的条带,但是条带不是很亮的那种,然后挑取转化子菌液培养,抗生素的浓度足够高,提取质粒,总是在第三步十分钟离心之后,上清液都有些浑浊,离心力足够大,时间足够长继续提取检测,都没有提取到质粒。试剂盒没有问题,因为同批转化的载体质粒能提取出来。
       急求各位有遇到类似问题的给出宝贵的意见,不胜感激。
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喜欢生物,所以想好好研究下去!
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gyesang

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引用回帖:
15楼: Originally posted by wu-ke-da at 2015-09-08 08:12:00
就是还是存在有效的菌落的,是吧?因为我也在想这个问题,既然有转化子,不就代表连接和转化成功了吗?因为平板都是加了抗性的,宿主菌又没有抗性,只有质粒载体上有抗性啊...

你有什么证据表明你载体被酶切开了?拿酶切后的载体,同样加酶连接,看看是否还能长出菌落?如果有菌落长出就说明载体没有被完全酶切开
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
19楼2015-09-10 11:58:35
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chenyuanxmc

金虫 (著名写手)

没遇到过这种情况,会不会是杂菌啊

发自小木虫Android客户端
2楼2015-09-03 13:21:52
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-04 22:58:26
因为你用的是目的基因的PCR引物,所以菌落PCR都是假阳性。如果你想菌落PCR鉴定的话,就用载体上的引物,别用你目的基因的引物。
3楼2015-09-03 15:54:37
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gyesang

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【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
“转化子菌落PCR正确,有目的条带,但是条带不是很亮的那种”----基本都是假阳性,不用继续往下做了。

做菌落PCR,最好是用载体上的引物,或者一条载体上的一条基因特异引物搭配
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
4楼2015-09-04 05:06:59
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