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wu-ke-da

金虫 (小有名气)

学习的路上

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[求助] 转化子菌落PCR正确，但是菌液提取重组质粒一直提不到是什么原因？已有6人参与

最近做质粒重组，转化子菌落PCR正确，有目的条带，但是条带不是很亮的那种，然后挑取转化子菌液培养，抗生素的浓度足够高，提取质粒，总是在第三步十分钟离心之后，上清液都有些浑浊，离心力足够大，时间足够长继续提取检测，都没有提取到质粒。试剂盒没有问题，因为同批转化的载体质粒能提取出来。
急求各位有遇到类似问题的给出宝贵的意见，不胜感激。

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喜欢生物，所以想好好研究下去！

1楼 2015-09-03 11:52:51

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

zeroon

木虫 (正式写手)

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专业: 微生物遗传育种学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

三楼四楼说的是对的，但也不一定。用目的基因的引物PCR，假阳性的条带比阳性条带要淡，这点还是能区分出来的。牙签点菌的时候别戳到培养基上，只在菌落表明粘一下就好。

另外，你提取质粒的方法操作有问题，中和后离心，上清液不会浑浊，即使菌体量没裂解完全大也不会。你好好对照分子克隆手册或者试剂盒说明书看，自己究竟哪一步有问题。这种问题都不用师兄师姐演示的，因为太简单了，说白了就是你操作问题。

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