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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr 不出目的条带
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肉肉-rourou

铁虫 (初入文坛)

[交流] pcr 不出目的条带 已有4人参与

半个月前设计的引物，用DNA跑出条带后，送去测序，与设计的相吻合。可是最近跑PCR，只有质粒出，DNA一个条带都不出，不知道什么原因，是需要改变体系么？怎么改体系呢？新手，谢谢啦！用过两个体系尝试，如下：
反应体系：20                 体系2：20
dNTP  0.5                     dNTP   0.4
Buffer  0.5                    Buffer  2
ddH2O  13.5                 ddH2O  10.4
上游引物  2                   上游引物：1.5
下游引物  2                   下游引物：1.5
DNA  1                          DNA   4

pcr 不出目的条带
untitled.png
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1楼 2015-07-17 13:58:04
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great07225388

新虫 (著名写手)
★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-07-17 22:58:08
是以前跑pcr能出结果，现在跑，出不来了吗？如果是，模板可能降解了，建议下次把模板跑个胶看看有没有降解。或者什么东西加错了，或者上下游引物忘了加其中的一个，等等。先排除主观原因，再排除客观原因。祝实验顺利！

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2楼2015-07-17 17:09:53
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没想好名字

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
话说你的酶呢？dntp和buffer各2ul，引物1ul，模板你就要做个梯度试一下了
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3楼2015-07-19 09:04:11
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肉肉-rourou

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 没想好名字 at 2015-07-19 09:04:11
话说你的酶呢？dntp和buffer各2ul，引物1ul，模板你就要做个梯度试一下了

酶忘记写了。。。之前跑出来的模板不可以直接用么？
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4楼2015-07-20 14:05:52
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肉肉-rourou

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by great07225388 at 2015-07-17 17:09:53
是以前跑pcr能出结果，现在跑，出不来了吗？如果是，模板可能降解了，建议下次把模板跑个胶看看有没有降解。或者什么东西加错了，或者上下游引物忘了加其中的一个，等等。先排除主观原因，再排除客观原因。祝实验顺 ...

是啊，之前有的。排除了东西忘加的问题，东西也都换过新的。模板是最近新提取的，应该没有降解啊。。。
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5楼2015-07-20 14:08:59
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great07225388

新虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
5楼: Originally posted by 肉肉-rourou at 2015-07-20 14:08:59
是啊，之前有的。排除了东西忘加的问题，东西也都换过新的。模板是最近新提取的，应该没有降解啊。。。...

这样啊，做个阳性对照试试。祝实验成功哦！

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6楼2015-07-20 15:04:29
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土豆没了

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
最近在做PCR，也遇到过这种情况，但是后面不知道怎么滴它也能出来，换模版换程序换试剂都试过，个人感觉模版放-20是没问题的，没有那么容易降解，还有就是混匀问题，体系最好按照试剂说明书上面的
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生活因拼搏而精彩，生命因奋斗而高贵
7楼2015-07-27 16:35:55
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
排除了模板问题，引物也需要验证，此外注意优化体系，摸索退火温度吧，具体操作还是看自己，可以产生热启动PCR酶扩增，高保真taq聚合酶类的热启动形式也可以采用，扩增效果很好
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
8楼2015-07-27 17:07:41
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