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肉肉-rourou

铁虫 (初入文坛)

[交流] pcr 不出目的条带 已有4人参与

半个月前设计的引物,用DNA跑出条带后,送去测序,与设计的相吻合。可是最近跑PCR,只有质粒出,DNA一个条带都不出,不知道什么原因,是需要改变体系么?怎么改体系呢?新手,谢谢啦!用过两个体系尝试,如下:
反应体系:20                 体系2:20
dNTP  0.5                     dNTP   0.4
Buffer  0.5                    Buffer  2
ddH2O  13.5                 ddH2O  10.4
上游引物  2                   上游引物:1.5
下游引物  2                   下游引物:1.5
DNA  1                          DNA   4

pcr 不出目的条带
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great07225388

新虫 (著名写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-07-17 22:58:08
是以前跑pcr能出结果,现在跑,出不来了吗?如果是,模板可能降解了,建议下次把模板跑个胶看看有没有降解。或者什么东西加错了,或者上下游引物忘了加其中的一个,等等。先排除主观原因,再排除客观原因。祝实验顺利!

[ 发自小木虫客户端 ]
2楼2015-07-17 17:09:53
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没想好名字

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
话说你的酶呢?dntp和buffer各2ul,引物1ul,模板你就要做个梯度试一下了
3楼2015-07-19 09:04:11
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肉肉-rourou

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 没想好名字 at 2015-07-19 09:04:11
话说你的酶呢?dntp和buffer各2ul,引物1ul,模板你就要做个梯度试一下了

酶忘记写了。。。之前跑出来的模板不可以直接用么?
4楼2015-07-20 14:05:52
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肉肉-rourou

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by great07225388 at 2015-07-17 17:09:53
是以前跑pcr能出结果,现在跑,出不来了吗?如果是,模板可能降解了,建议下次把模板跑个胶看看有没有降解。或者什么东西加错了,或者上下游引物忘了加其中的一个,等等。先排除主观原因,再排除客观原因。祝实验顺 ...

是啊,之前有的。排除了东西忘加的问题,东西也都换过新的。模板是最近新提取的,应该没有降解啊。。。
5楼2015-07-20 14:08:59
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great07225388

新虫 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
5楼: Originally posted by 肉肉-rourou at 2015-07-20 14:08:59
是啊,之前有的。排除了东西忘加的问题,东西也都换过新的。模板是最近新提取的,应该没有降解啊。。。...

这样啊,做个阳性对照试试。祝实验成功哦!

[ 发自小木虫客户端 ]
6楼2015-07-20 15:04:29
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土豆没了

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
最近在做PCR,也遇到过这种情况,但是后面不知道怎么滴它也能出来,换模版换程序换试剂都试过,个人感觉模版放-20是没问题的,没有那么容易降解,还有就是混匀问题,体系最好按照试剂说明书上面的
生活因拼搏而精彩,生命因奋斗而高贵
7楼2015-07-27 16:35:55
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
排除了模板问题,引物也需要验证,此外注意优化体系,摸索退火温度吧,具体操作还是看自己,可以产生热启动PCR酶扩增,高保真taq聚合酶类的热启动形式也可以采用,扩增效果很好
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
8楼2015-07-27 17:07:41
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