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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 网络生活区 » 有奖问答 » 实验讨论 » PCR 目的条带出不来
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chengyun5

捐助贵宾 (小有名气)

[求助] PCR 目的条带出不来

我的目的片段是3000bp  左右  PCR体系是25ul
               上下游引物各0.5ul     
                模板 0.5ul
                双蒸水11ul
                Prime star  12.5ul
PCR条件 98℃  5min   预变性
              98℃   10s
              50℃   5s
              72℃   1min   72℃   10min  终延伸  电泳后条带如图，我试着改变了退火温度 55℃  60℃ 可是都不对

PCR  目的条带出不来
dd.jpg
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1楼2014-05-23 10:43:11
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回帖置顶 ( 共有1个 )

飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★
chengyun5: 金币+1, 博学EPI+1 2014-05-27 15:48:33
建议楼主做一个touchdown PCR
Tm从60降到50，试一下。
赞一下 回复此楼
人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
2楼2014-05-27 11:05:33
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普通回帖

elise1987

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

确定模版没问题，引物没合错？建议楼主搞个阳性对照在旁边排除一下，然后对pcr条件进行优化，如楼上所说降落伞PCR可以一试，极大限度排除非特异性扩增。另外也可以用梯度PCR仪筛选一下退火温度。还有，模版浓度过高也可能导致P不出来。个人感觉这是个很简单的反应。。。只要东西没用错。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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不折腾，不胡闹，珍惜时间和生命
3楼2014-07-07 22:15:34
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