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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 大肠杆菌阴性对照
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chenyanzhen

铁虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌阴性对照 已有2人参与

之前用以下这对引物扩增大肠杆菌（DH5A,BL21，EAEC,EHEC,EIEC,EPEC,ETEC）,都没有扩增信号，但是我在NCBI上能搜到相应的扩增序列
AACTATTGGGTTTACCGCG
ACCAATTGCTGGAGCATAATCT
后来换成另一对,在NCBI上没搜到相应的扩增序列，但7种模板全部都有扩增信号，连6管阴性（加水）都有。阴性Ct值还很靠前，有想过是聚合酶中的DNA残留，但不知要怎么验证。
TGGGATCTGCCATTGTCAGA
CACTGGTGTGGCCATAATTC
哪位高手帮帮忙？

大肠杆菌阴性对照
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活在当下，充实自己
1楼 2015-06-01 09:18:14
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
先用琼脂糖凝胶电泳检测下，看看是否阴性对照也是有的。
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2楼2015-06-01 14:16:17
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07bio

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1. 先跑电泳看下是否有目的条带，确定真的是PCR扩增出来的。
2. 如果电泳有目的条带，要先怀疑是否是污染引起的，毕竟你阴性对照都有信号。以我的经验，DNA聚合酶残留的DNA不足以引起扩增信号。
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3楼2015-06-01 16:41:34
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chenyanzhen

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 07bio at 2015-06-01 16:41:34
1. 先跑电泳看下是否有目的条带，确定真的是PCR扩增出来的。
2. 如果电泳有目的条带，要先怀疑是否是污染引起的，毕竟你阴性对照都有信号。以我的经验，DNA聚合酶残留的DNA不足以引起扩增信号。

情况已经跟领导讨论过了，阴性应该就是酶中的残留DNA引起的。
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活在当下，充实自己
4楼2015-06-01 17:54:25
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