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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 关于真菌的转化问题
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sweetyoo0

新虫 (初入文坛)

[交流] 关于真菌的转化问题 已有4人参与

敲除真菌相关的一目的基因，已构建同源整合片段已连接载体，打算提取质粒后双酶切获得片段再转化，转化时要求有10ug，浓度1ug/ul（方法与PEG介导的曲霉原生质体转化原理一样），但酶切后浓度偏低达不到，请问各位童鞋都是采用什么方法达到这个浓度，先谢谢各位啦(ಥ_ಥ

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1楼 2015-04-28 23:37:55
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wopopwz123

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-29 18:49:18
你如果是需要敲除基因，你可以使用PCR产物直接进行敲除，看你实验目的了。具体你可以问我，我做过真菌的原生质体转化。
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2楼2015-04-28 23:41:16
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sweetyoo0

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wopopwz123 at 2015-04-28 23:41:16
你如果是需要敲除基因，你可以使用PCR产物直接进行敲除，看你实验目的了。具体你可以问我，我做过真菌的原生质体转化。

pcr产物不用回收吗？产物中其他成分会影响转化吧？现在参考的转化方法与曲霉转化相似，protocol中说明原生质体100加10ug的DNA，浓度达1ug/ml，只加10ul，是不是必须按照这个比例加入呢？？我目前打算导入同源整合片段来敲出真菌中的gene，而非质粒

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3楼2015-04-28 23:52:08
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wopopwz123

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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-29 18:49:31
引用回帖:
3楼: Originally posted by sweetyoo0 at 2015-04-28 23:52:08
pcr产物不用回收吗？产物中其他成分会影响转化吧？现在参考的转化方法与曲霉转化相似，protocol中说明原生质体100加10ug的DNA，浓度达1ug/ml，只加10ul，是不是必须按照这个比例加入呢？？我目前打算导入同源整合片 ...

如果你是提取质粒我建议你用试剂盒提取，这样效果好一些。自己手提的效果不太好，会影响转化的。PCR产物需要回收的，然后再进行转化。如果是敲除两种方法都可以试试。
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4楼2015-04-29 00:29:48
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sweetyoo0

新虫 (初入文坛)
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4楼: Originally posted by wopopwz123 at 2015-04-29 00:29:48
如果你是提取质粒我建议你用试剂盒提取，这样效果好一些。自己手提的效果不太好，会影响转化的。PCR产物需要回收的，然后再进行转化。如果是敲除两种方法都可以试试。...

但是pcr回收后浓度很低，达不到要求浓度，请问你是用多少浓度，多少量的DNA做得转化呢？？谢谢~

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5楼2015-04-29 08:36:17
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zbl217

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你是用什么方法转化？
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6楼2015-05-20 17:41:13
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混合配搭

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你好,我也刚做请问你是怎么构建的载体啊？
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7楼2015-07-09 17:22:24
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混合配搭

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by wopopwz123 at 2015-04-28 23:41:16
你如果是需要敲除基因，你可以使用PCR产物直接进行敲除，看你实验目的了。具体你可以问我，我做过真菌的原生质体转化。

你好，怎么构建基因敲除的载体啊？我没有想敲除这个基因的全长，是不是得先提DNA扩增全长才能设计引物和载体啊？
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8楼2015-07-09 17:24:24
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wopopwz123

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8楼: Originally posted by 混合配搭 at 2015-07-09 17:24:24
你好，怎么构建基因敲除的载体啊？我没有想敲除这个基因的全长，是不是得先提DNA扩增全长才能设计引物和载体啊？...

你打算做部分敲除？
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9楼2015-07-09 23:03:53
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liz_xin7

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2楼: Originally posted by wopopwz123 at 2015-04-28 23:41:16
你如果是需要敲除基因，你可以使用PCR产物直接进行敲除，看你实验目的了。具体你可以问我，我做过真菌的原生质体转化。

你好，我想问下，我现在用PEG介导的曲霉原生质体转化的方法转化曲霉菌，但是已经做了4个月了，其中又更换过各种条件 ，一直没有长出克隆来，想请教下，可能的造成这样情况的原因有哪些，谢谢
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10楼2018-12-14 10:44:55
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