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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » 急救！！！关于农杆菌转化的一些问题
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XLJ海阔天空

金虫 (小有名气)

[求助] 急救！！！关于农杆菌转化的一些问题

虫友们好!  我i是做的苜蓿的转基因，遇见以下问题，请各位朋友帮助，马上就该毕业了，转基因还是没长出来，急死了！实验室之前没人做过这方面的，急需您的指点！！！

1、再生体系已经建立，成功获得再生植株。然后我就按照再生体系的培养基配方来做转化。自己认为理论上用相同的培养基肯定应该可以转化出苗的，但是一直没有结果。我的这种假设是错误的吗？
2、在农杆菌侵染过后，外植体形成胚性愈伤较难，加卡纳筛选后很多都褐化，或者发黄。有的前期看着状态蛮好，但是继代一次，愈伤就变的疏松，没有内核，不知道是什么缘故？
3、相同的品种、相同的部位的外植体，培养基、培养条件什么的全都相同，但是在预培养3天后，有的下胚轴愈伤启动，但是有的发褐，这种情况在我筛选合适的细胞分裂素浓度和生长素浓度时也屡次出现。不知道是什么原因，难道外植体本身个体差异那么大？
4、在看不同抗生素浓度对愈伤形成及生长的影响时，抗生素600mg/l时居然比抗生素浓度200mg/l的愈伤长势还好？每个处理3个重复的话，都会有一个愈伤一个也不长，发黄，没反应了，郁闷，筛选不出来结果

请指教，万分感谢！！！
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1楼2012-01-05 17:56:19
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lw19850128

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jhu132llh(金币+4, APEPI+1): 鼓励积极分享 2012-01-06 16:45:05
XLJ海阔天空(金币+1): ★★★★★最佳答案 非常感谢您耐心详细的解答，非常感谢您！ 2012-01-06 20:08:30
先简单回答下你的问题：
1，理论上可行，但经过农杆菌处理后，细胞都会受到程度不同的伤害，很可能影响细胞的生长和分化，如果侵染后严重影响，可以改变侵染的菌液浓度 和时间。另外侵染过后将愈伤或外植体置于条件适宜的恢复培养基培养也很重要。另外，你再生体系的再生效率能达到多少？
2，侵染后愈伤组织难以分化比较正常，加kan后变黄应该是未转入抗性基因的细胞，继代后变疏松不知你继代前后培养基有什么区别，还是建议侵染或共培后先在不加筛选剂的培养基上恢复一个周期。
3，这种情况也比较常见，正常来讲个体差异存在，不过其他影响因素也比较多，不知你的外植体取得什么部位？很容易辨认么？
4，如果是kan筛选的话是会出现这种情况，kan本身就很不稳定，尤其是加入培养基的时候不能太热，另外不知道你做梯度试验的个体数有多少，太少的话也不容易对照出来，不确定苜蓿转化的情况，对于其他植物来说200mg已经比较大的浓度了，建议试下100mg。

植物转基因本来就很难，周期长，且每一步都可能影响到最后的转化结果，再生体系正常的话（效率50%以上吧），主要精力需要放在侵染条件控制上，毕竟农杆菌的侵染还是会对植物细胞造成损伤。简单讲讲，我也算是新手。
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XLJ海阔天空
2楼2012-01-06 09:38:53
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XLJ海阔天空

金虫 (小有名气)
送鲜花一朵
SongQ5285: 看来交流很重要。。。 2012-01-06 23:55:18
引用回帖:
楼: Originally posted by lw19850128 at 2012-01-06 09:38:53:
先简单回答下你的问题：
1，理论上可行，但经过农杆菌处理后，细胞都会受到程度不同的伤害，很可能影响细胞的生长和分化，如果侵染后严重影响，可以改变侵染的菌液浓度 和时间。另外侵染过后将愈伤或外植体置于条 ...

首先真的非常感谢您的耐心详细的回复，真后悔没有早点发帖！嘿嘿
1、我是选了四个品种，愈伤诱导培养基相同，5个不同的分化培养基筛选，因为污染等原因，最后只有一个品种的一种分化培养基分化出苗，陆陆续续的，再生效率在55%左右吧，后来转化体系就按照再生体系的这个来做转化了。
2、继代前后的的培养基是相同的。目前做着几批，就先不加卡纳，暗培养一周。
3、外植体用的下胚轴，后来又尝试子叶、叶柄。您说的容易辨认是指什么啊？
4、卡纳我筛选也是上面那这种情况，然后看文献上很多都是用的50mg，就按50mg加了。每个处理3个重复，每个重复1皿，25个外植体。
   谢谢你给的建议！！！
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3楼2012-01-06 20:47:12
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lw19850128

银虫 (小有名气)
★ ★
SongQ5285(金币+2): “入门而已”，我觉得你很认真。。。 2012-01-09 11:43:17
引用回帖:
3楼: Originally posted by XLJ海阔天空 at 2012-01-06 20:47:12:
首先真的非常感谢您的耐心详细的回复，真后悔没有早点发帖！嘿嘿
1、我是选了四个品种，愈伤诱导培养基相同，5个不同的分化培养基筛选，因为污染等原因，最后只有一个品种的一种分化培养基分化出苗，陆陆续续的 ...

容易辨认就是切取外植体的时候能清楚地确定组织部位，例如，如果胚发育尚未完全的时候无法准确区分上下胚轴。

重复只做25个可能看不太出来，我一般以100为单位都觉得有点不好分辨

就是这些吧  组培确实挺麻烦的，我也只是刚入门而已~
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4楼2012-01-09 09:45:38
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cato8163

银虫 (正式写手)
苜蓿转化不好做。
做转化以前，再生达到很高的频率，转化才能得到独立的转基因株系。
外植体的选择非常重要，如果选择下胚轴，不建议，因为基因型不一样，不利于后续的分析，难以排除，结果不可靠。
还是多看看，国外的资料，会有很大启发。
小可也是新手，以上仅代表个人观点。
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5楼2012-06-25 20:35:12
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confus

新虫 (小有名气)
楼上的回复很详细，学习了。请问有没有人用发根农杆菌K599和LBA1334的？
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6楼2013-10-02 22:53:01
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